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目的:视网膜S抗原的致葡萄膜炎活性与其纯度呈正相关,所以S抗原的纯化尤为重要。本实验以Al-Mahdawi等的方法为依据进行改进简化,快速高效地获得较高纯度的牛视网膜S抗原,并用纯化的S抗原免疫Lewis大鼠,复制EAU疾病模型,为葡萄膜炎发病机制和免疫治疗的实验研究提供工具。 方法:(1) 提纯S抗原:利用盐析、分子筛和离子交换层析等方法纯化S抗原。冰浴下制备新鲜牛视网膜匀浆,选用Sephadex G 100凝胶同时进行除盐和分子筛层析,简单省时,样品回收率高,再经DEAE-Sephadex A50凝胶进一步分离纯化,收集经电泳证实为S抗原的洗脱液,透析浓缩,测定蛋白含量,调整浓度为1mg/ml,-20℃冻存备用。 (2) S抗原的分析:①生化分析:Bradford法测定总蛋白浓度,计算S抗原含量;采用不连续SDS-PAGE电泳,与分子量标准蛋白比较,计算测定蛋白分子量。②免疫活性分析:将纯化的S抗原与CFA等体积充分乳化,足垫下注射免疫Lewis大鼠,一周后尾静脉追加抗原,建立EAU疾病模型。 (3) 建立EAU疾病模型:选择6-8周龄雌性Lewis大鼠(165-185g)。将S抗原与CFA按1∶1体积比充分乳化,取200μl注射于Lewis大鼠的双后足垫,同时百日咳杆菌原液0.1ml腹腔注射,加强免疫。免疫后第7天尾静脉追加S抗原50μl。根据修改的Dick等的标准进行临床评分和组织学分级。 结果:(1) 提纯S抗原:用本实验方法在短周期内获得较高纯度具有免疫活性的S抗原,S抗原在洗脱液浓度为0.09-0.17mol/l时被洗脱,分离效果较好,蛋白含量为5%～7%;电泳显示单一蛋白条带,分子量约为53,000。平均每个牛眼视网膜可提纯300～400 μgS抗原。 (2) 建立EAU模型:在Lewis大鼠中成功地复制出EAU疾病模型,发病率达100%,临床及组织学特征稳定。