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中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)是继2002年非典型肺炎(Severe acute respiratory syndrome,SARS)爆发以来,出现的又一种由MERS冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)引起的高致病性人兽共患病。其传播源头为蝙蝠,感染人后,能够导致严重的肺炎、休克及器官衰竭等症状,致死率高达到35%以上。由于目前尚无获批的药物和疫苗用治疗和预防MERS临床感染,因此建立MERS-CoV快速检测和分型方法,以及进一步研制MERS的治疗性抗体与疫苗成为MERS防控的关键。中和抗体检测方法是疫病诊断、治疗和预防中最常用的方法。由于MERS为烈性人兽共患病,其病原操作必须在P3及以上生物安全实验室进行,因此依赖活毒的传统中和抗体检测方法极大地限制了中和试验在MERS研究中应用。MERS-CoV刺突蛋白(Spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)可特异性地识别和结合细胞表面受体二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DPP4),介导病毒细胞入侵和感染。同时,RBD也是MERS-CoV中和抗体表位富集区,针对RBD中和抗体既可以特异性阻断MERS-CoV对DPP4受体表达细胞的感染,又可以特异性阻断RBD与DPP4受体表达细胞的结合。基于以上原理,本论文以表达融合人IgG1 Fc的MERS-CoV RBD(rRBD-Fc)替代全病毒,以表面高表达DPP4受体蛋白的Huh-7细胞系和偶联DPP4受体蛋白的磁珠为载体,建立了两种不依赖活毒的MERS-CoV中和抗体流式细胞检测方法。1.本研究利用商品化的载体pFUSE-h IgG1-Fc真核表达载体带有Fc标签和EcoR I和Bgl II两个多克隆位点,合成两端带有Eco R I和Bgl II酶切位点的RBD序列,构建了重组表达载体pFUSE-RBD-h IgG1-Fc。将重组表达载体转染293T细胞,经纯化获得重组蛋白rRBD-Fc,利用SDS-PAGE和Western blot验证了重组蛋白成功表达,并且具有较高的纯度。2.将梯度稀释的rRBD-Fc与Huh-7细胞孵育,再结合FITC标记的抗Fc的荧光抗体,流式细胞术检测结果显示rRBD-Fc可与表面表达MERS-CoV DPP4受体的Huh-7细胞特异性结合,且rRBD-Fc最适结合量为0.25μg/1×10~5细胞。3.将rRBD-Fc蛋白与MERS-CoV RBD特异性中和抗体、特异性非中和抗体、MERS-CoV RBD免疫小鼠血清和MERS-CoV无关抗体分别混合后再与Huh-7细胞孵育,通过流式细胞术检测不同抗体对RBD与Huh-7结合的阻断作用。结果显示,建立的不依赖于活毒的MERS-CoV中和抗体检测方法能够定性和定量地检测以上四种类型抗体的病毒中和活性。4.为验证建立的不依赖于活毒的MERS-CoV中和抗体检测方法与传统依赖活毒的中和抗体检测方法是否具有一致性,对12份MERS-CoV中和抗体、6份rRBD-Fc免疫小鼠血清、6份正常小鼠血清、10份骆驼血清和10份健康人血清进行平行检测,结果显示,两种方法检测结果具有较高的一致性。5.考虑到Huh-7细胞状态对流式细胞术检测结果的干扰,进一步利用偶联DPP4蛋白的磁珠代替Huh-7细胞,结果显示偶联DPP4受体的磁珠(0.25μg DPP4/2μl磁珠)结合rRBD-Fc蛋白最佳剂量为0.4μg。将MERS-CoV RBD特异性中和抗体(如N10、hMS-1、RBD初免小鼠血清)、特异性非中和抗体(如N7)和MERS-CoV不相关血清(如正常人血清和小鼠免疫前血清)分别与rRBD-Fc蛋白孵育,结果显示只有MERS-CoV RBD中和抗体可有效阻断rRBD-Fc蛋白与偶联DPP4的磁珠特异性结合。证明同时不依赖活毒和细胞的MERS-CoV中和抗体检测方法也可代替传统MERS-CoV中和抗体检测方法。为克服传统中和抗体检测方法对活毒的依赖,本研究建立了无病毒和无细胞依赖的两种MERS-CoV新型中和抗体检测方法。与传统中和抗体相比,本研究所建立的方法安全性高、操作简便、周期短,后续有望在MERS的诊断、治疗和预防中得到广泛应用。