论文部分内容阅读
土地盐碱化严重影响作物和蔬菜的产量,深入研究盐胁迫的影响机制具有重要的意义。当植物受到盐胁迫时,会引起细胞内的一系列生理反应,比如一些盐胁迫信号通路中的蛋白会积累或者降解。泛素-26s蛋白酶体途径(ubiquity-26s proteosome pathway,UPP)是存在于真核生物体内的一种具有高度选择性的蛋白降解途径,对调控植物细胞中的生理生化环境有着极其重要的作用。E3连接酶是泛素-26s蛋白酶体途径中一种极为重要的酶。而U-box泛素连接酶是最早发现的一种E3泛素连接酶。植物中的U-box泛素连接酶PUB (plant U-box protein)蛋白对植物的生物和非生物胁迫、激素、生长和发育、自身免疫的响应中有着非常重要的作用。到目前为止,植物中很多种U-box E3连接酶的功能尚不清楚。本文以十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,通过分子生物学、生物化学等手段从生理水平、基因水平和蛋白水平研究了U-box E3连接酶AtPUB30和AtPUB31的生物学功能以及与其互作的蛋白。主要结果如下：1.拟南芥E3泛素连接酶突变体pub30和pub31对盐胁迫的生理响应。为了研究AtPUB30在植物细胞中的功能,不仅对AtPUB30以及与其高度同源的AtPUB31做了生物信息学的分析,还利用pub30和pub31观察其在盐胁迫下的种子萌发状况。研究发现在150mM NaCl浓度下,pub30-1、pub30-3的萌发率高于col-0, pub31-1的萌发率低于col-0, pub30-lpub31-1萌发率在col-0和pub31-1之间。实验结果表明,在萌发过程中AtPUB30及AtPUB31对盐胁迫的响应分别具有负调控和正调控作用。2. atpub30-1突变体回补种子在盐胁迫下的生理响应。本文在实验室原有的pCAM BIA1305.1-GFP载体基础上,利用In-fusion载体连接技术,继续在GFP基因的上游和下游分别连入拟南芥pub30启动子和pub31启动子基因,下游分别连入pub30和pub31基因组基因,经过大肠杆菌的转化,抗卡那霉素筛选,质粒的提取和鉴定,农杆菌的转化和活化,侵染,筛选,蛋白表达检测,最终成功获得了pub30-1/PUB30转基因T1代种子,但未能筛选出pub31-1/PUB31阳性植株。点播col-0, pub30, pub30-1/PUB30种子于含有150mM NaCl的1/2MS平板培养基上,5天后观察发现pub30-1/PUB30萌发率接近col-0, pub30-1萌发率高于col-0和pub30-1/PUB30。实验结果表明基因回补使pub30-1表型部分被恢复,同时也进一步证明在萌发过程中AtPUB30对盐胁迫的响应起负调控作用。3.运用酵母双杂交技术筛选与AtPUB30、AtPUB31互作的14-3-3蛋白。14-3-3是能够与磷酸化的氨基酸残基结合的高度保守的分子伴侣蛋白。与14-3-3蛋白结合的蛋白通常会改变自身的稳定性、酶活性、亚细胞定位或者更易于与其它蛋白结合。以atpub30和atpub31的CDS全长序列为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选拟南芥中与它们互作的14-3-3蛋白。AH109和Y187上有亮氨酸、色氨酸、组氨酸3个激活来指示目的蛋白之间的相互作用。筛选得到的酵母阳性单克隆用缺陷平板验证。最后得到AtPUB30的阳性克隆2个,AtPUB31的阳性克隆1个。实验结果表明与AtPUB30互作的14-3-3蛋白是OMICRON和OMEGA,与AtPUB31互作的蛋白是IOTA。