类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎症性、自身免疫性疾病,其典型病理特征包括关节炎症、血管翳形成、滑膜增生以及骨和软骨的损伤。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是构成RA滑膜组织的主要成分,约占滑膜组织的70%左右。过度活化的FLS具有类肿瘤样增殖、迁移的能力,FLS迁移至软骨可造成血管翳的形成和关节的损伤。CXC L12是一种趋化因子,在RA患者滑膜液中表达水平升高,CXCR4是一种可与CXC L12特异性结合的GPCR受体,当CXCL12/CXCR4信号异常活化时可导致FLS过度迁移,造成血管翳的形成和关节的损伤。芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,代号:CP-25)是本课题组对白芍总苷主要有效成分芍药苷(paeoniflorin,Pae)进行结构修饰,得到的一种新型活性单体,与Pae相比,CP-25具有较好的脂溶性,生物利用度明显提高。课题组前期研究表明在整体水平上,CP-25可以明显降低RA动物模型的关节炎指数、关节肿胀度、关节肿胀数、全身评分,改善关节和脾脏病理。细胞水平上,CP-25可以抑制FLS增殖、迁移,抑制FLS、巨噬细胞、T细胞等分泌炎性细胞因子的能力。GRK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要作用是参与GPCR脱敏内吞过程,也可通过与多种分子相互作用进而调控下游信号通路,如PI3K/AKT、ERK等。免疫细胞中GRK2水平的改变在炎症免疫反应中起着重要作用,在CIA小鼠模型中GRK2表达水平增加,促进关节炎发展。课题组前期研究表明CP-25可抑制人脐静脉内皮细胞中GRK2从胞浆转位至胞膜参与ERK1/2信号通路减少新生血管生成。CP-25上调滑膜细胞胞膜β-AR的表达,下调胞膜GRK2的表达。课题组前期研究表明在胶原诱导性关节炎大鼠(collagen-induced arthritis,CIA)模型中,Pae可以下调PI3K/AK T信号通路相关蛋白的表达,进而发挥对CIA大鼠的治疗作用。PI3K/AKT是一条经典的与细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成有关的信号通路,很多研究表明该信号通路的过度活化与癌细胞的迁移过程有关。此外,当GPCR与相应配体结合时,可导致G蛋白的活化,引起Gα与Gβγ亚基的解离,解离的Gβγ亚基可募集GRK2、PI3K等分子至细胞膜上,并在膜上活化PI3K。因此,我们猜测CP-25调节RA中FLS过度迁移是否与GRK2及其相互作用分子PI3K/AKT有关?本课题选取RA和OA患者滑膜组织,及MH7A细胞株为研究对象,从临床样本和细胞水平两个层次对RA中FLS过度迁移的分子机制进行阐述。通过Transwell检测CP-25是否可抑制RA中FLS过度迁移,Western blot、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、激光共聚焦(laser scanning confocal microscopy,LSCM)等方法进一步检测其分子机制是否与GRK2及其相互作用分子PI3K/AKT有关。目的:1.明确RA患者滑膜组织中PI3K/AKT信号过度活化是否与CXC R4过表达有关。2.明确CP-25是否可调节PI3K/AKT信号通路参与FLS的迁移功能。3.明确CP-25调节PI3K/AKT信号通路的具体分子机制。方法:1.收集RA和骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者滑膜组织,用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)和Western blot检测RA和OA患者滑膜组织中CXCR4、GRK2、Gβ、p110β、p85、p-p85、AKT、p-AKT等蛋白的表达情况;2.Transwell检测C XCL12对MH7A细胞迁移能力的影响及CP-25的作用;3.Western blot检测CXC L12对MH7A细胞中GRK2、Gβ、p110β、p85、p-p85、AKT和p-AKT等蛋白表达的影响及CP-25的作用;4.Western blot检测CXCL12对胞膜和胞浆GRK2、Gβ、PI3Kβ(p110β)的影响及CP-25的作用;5.Co-IP和LSCM检测CXCL12对GRK2与Gβ、PI3Kβ(p110β)与Gβ共表达的影响及CP-25的作用。结果:1.RA和OA患者滑膜组织中CXCR4、GRK2、Gβ、p110β、p85、p-p85、AKT、及p-AKT蛋白表达变化收集8名RA患者滑膜组织,9名OA患者滑膜组织。与OA患者滑膜组织相比,RA患者滑膜组织中CXCR4、GRK2、Gβ、p-p85及p-AKT蛋白的表达均升高,提示RA患者滑膜组织中PI3K/AKT信号通路过度活化。2.RA和OA患者滑膜组织中CXCR4受体与p-p85、p-AKT蛋白表达相关性分析与OA患者滑膜组织相比,RA患者滑膜组织中CXCR4受体表达增加,且与p-p85、p-AKT蛋白的高表达呈正相关,提示RA患者滑膜组织中CXCR4蛋白过表达与PI3K/AKT信号过度活化有关。3.CXCL12对MH7A细胞迁移能力的影响及CP-25的作用与control组相比,100ng/ml CXCL12刺激30min可增加MH7A细胞的迁移;与100ng/ml CXCL12组相比,浓度为0.1μM、1μM的CP-25可降低MH7A细胞的迁移;与100ng/ml CXCL12组相比,浓度为10μM、20μM的Gβγ抑制剂(gallein)减少MH7A细胞的迁移。4.CXCL12对MH7A细胞GRK2、Gβ、p110β、p85、p-p85、AKT及p-AKT蛋白表达的影响及CP-25的作用与control组相比,100ng/ml CXCL12刺激30min可增加MH7A细胞中p-p85、p-AKT蛋白的表达,对GRK2、Gβ、p110β、p85和AKT蛋白的表达无明显改变;与100ng/ml CXCL12组相比,浓度为0.1μM、1μM的CP-25可降低MH7A细胞中p-p85和p-AKT蛋白的表达,对GRK2、Gβ、p110β、p85和AKT蛋白的表达无明显改变;与100ng/ml CXCL12组相比,浓度为10μM、20μM的Gβγ抑制剂(gallein)降低MH7A细胞中p-p85、p-AKT蛋白的表达,对GRK2、Gβ、p110β、p85和AKT蛋白的表达无明显改变。5.CXCL12对MH7A细胞中胞膜及胞质中GRK2、Gβ、PI3K表达的影响及CP-25的作用与control组相比,100ng/ml CXCL12刺激30min可增加MH7A细胞中胞膜上GRK2、Gβ及PI3K的表达,降低胞质中GRK2、Gβ及PI3K的表达;与100ng/ml CXCL12组相比,1μM的CP-25可降低MH7A细胞中胞膜GRK2、Gβ及PI3K的表达,升高胞质GRK2、Gβ及PI3K的表达。6.CXCL12对MH7A细胞中GRK2与Gβ、Gβ与PI3K共结合的影响及CP-25的作用与control组相比,100ng/ml CXCL12刺激30min可增加MH7A细胞中GRK2与Gβ、Gβ与PI3K共结合的表达;与100ng/ml CXCL12组相比,1μM的CP-25可降低MH7A细胞中GRK2与Gβ、Gβ与PI3K共结合的表达。结论:1.RA患者滑膜组织中CXC R4、GRK2、Gβ、p-p85及p-AKT蛋白表达升高,且CXCR4受体的过表达与PI3K/AKT信号通路过度活化呈正相关。2.CP-25可以抑制CXCL12诱导的MH7A细胞过度迁移,且其机制与下调PI3K/AKT信号通路有关。3.CP-25下调MH7A细胞中PI3K/AKT信号通路,与抑制GRK2-Gβγ膜转位,进而间接减少PI3K膜表达及其活化、抑制AKT过度活化有关。