论文部分内容阅读
目的:目前临床应用的抗骨质疏松药物带来治疗作用的同时副作用不容忽视,有效低毒的新药研发仍在进行中。文献报道传统中草药蛇床子及其活性成分蛇床子素具有用于骨质疏松的治疗作用,本论文通过研究蛇床子素与骨调节靶点的结合情况,对成骨细胞调节的机制以及代谢酶多态性相关作用的研究,明确蛇床子素作为新型治疗骨质疏松药物的特点及可能性。方法:1.计算机模拟蛇床子素和多靶点骨调节信号因子的分子对接。2.应用细胞增殖实验观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞增殖能力的影响。应用磷酸苯二钠实验法测定蛇床子素对人成骨样MG-63细胞分化功能的影响。应用DAPI染色法观察蛇床子素对凋亡诱导剂诱导的人成骨样MG-63细胞凋亡的影响。应用半定量RT-PCR和Western Blot技术观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞OPG、RANKL、Osterix表达的影响。测定蛇床子素对P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白时间表达的影响。3.应用雌激素受体阻断剂ICI 182780,MEK抑制剂PD 98059,PI3K抑制剂Wortmannin和Wnt抑制剂DKK-1检测其对蛇床子素调节作用的阻断。检测阻断剂对蛇床子素对OPG、RANKL和Osterix调节的阻断。测定阻断剂对蛇床子素P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白调节作用的阻断。4.建立LC-MS/MS的CYP2C9经典探针底物双氯芬酸、CYP2D6经典探针底物右美沙芬代谢物测定方法并进行方法学验证,测定蛇床子素对不同代谢酶基因型药物代谢的影响。结果:1.对接结果表明,蛇床子素和骨代谢调节相关的多个靶点具有不同程度的结合能力,从微观机制展示了多靶标作用的可能性。2.蛇床子素的促成骨作用主要表现为促分化,小剂量蛇床子素能够促进MG-63细胞增殖,抑制细胞凋亡,提高细胞中OPG/RANKL的mRNA及蛋白比率,上调Osterix mRNA和蛋白的表达,促使细胞内P-ERK、P-AKT表达增多,细胞浆内β-catenin蛋白降低,细胞核内β-catenin蛋白升高。3.ICI 182780、PD98059、Wortmannin和DKK-1均可部分阻断蛇床子素的促增殖分化作用,部分阻断蛇床子素对OPG、RANKL、Osterix的mRNA及蛋白表达的调节。提示该四种信号通路在蛇床子素调节成骨细胞中均参与发挥作用。4.蛇床子素对3种CYP2C9、4种CYP2D6基因型药物代谢酶的半数抑制浓度分别为:CYP2C9*1,91.51μM;CYP2C9*2,104.5μM;CYP2C9*3,120.4μM;CYP2D6*1,61.86μM;CYP2D6*2,74.09μM;CYP2D6*10,47.95μM;CYP2D6*39,56.99μM。结论:蛇床子素的促成骨作用涉及多靶点、多条信号通路,对常见存在多态性的代谢酶作用弱。由于骨质疏松需要长期用药,蛇床子素具有多靶点、相互作用少的特点,和现有的抗骨质疏松药物相比,具有作为一个新型治疗骨质疏松药物的良好前景。