羽苔素(Riccardin D, RD),是由苔藓植物地钱中提取分离得到的一种新型的双联苄类化合物,具有抗真菌、逆转真菌多药耐药性、以及诱导细胞凋亡等多种药理作用。然而RD溶解性差导致的低生物利用度等系列问题阻碍了其转向临床应用的可能。为此,本文拟通过制备RD纳米混悬剂,增加其溶解度,提高生物利用度,以达到临床前药学评价的目的。在完成临床前药学评价的基础上,以RD为模型药物,以生物相容性好的羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸为骨架材料,接枝具有pH敏感性的聚(β-氨基酯)和能够识别多种肿瘤细胞受体靶点的叶酸,并在胶束外层连接PEG亲水端,制备成在体内具有pH敏感性、主动靶向性且延长循环时间的多功能胶束,以延长RD制剂的半衰期并增强其主动靶向性。因此,全文分为两个部分：第一部分为RD临床前药学评价的一部分,即RD纳米混悬液的研究；第二部分在第一部分基础上进行深入研究,以开发新剂型和新技术为目的,制备成RD多功能胶束。在本课题第一部分研究中,采用沉淀法和微射流法两种方法制备了纳米混悬液。通过透射电镜观察其形态,并对其粒径分布、表面电荷进行了研究。在沉淀法中,以溶解RD的乙醇溶液等有机相作为溶剂,将稳定剂泊洛沙姆188(F68)、羟丙甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)溶解于水相作为反溶剂,溶剂与反溶剂混合后制备纳米混悬剂。在微射流法中,考察均质压力与循环次数对纳米混悬液的影响。理化性质研究表明,通过沉淀法制备的纳米混悬液比微射流法制备的纳米混悬液粒径更小且更加均匀。为进一步提高纳米混悬剂的稳定性,本课题系统研究了RD纳米混悬剂的冷冻干燥过程,利用LC-MS及HPLC考察了RD冻干粉的饱和溶解度、体外溶出度及储存稳定性,采用DSC和XRD技术对其晶型结构进行了分析。最后利用HPLC比较了两种方法制备的RD纳米混悬液经静脉注射后在小鼠体内的组织分布特征以及药物动力学特征,以期通过增加肺靶向的分布实现RD对肺部疾病治疗的目的。通过处方筛选,沉淀法的最佳处方确定为RD:F68:HPMC:PVP K30=2:1:2:1,选用稳定性能良好的F68、HPMC、PVPK30作为稳定剂。将处方量的RD溶于无水乙醇中作为有机相；将处方量的稳定剂均匀分散在双蒸水中得到水相；0-3℃冰浴和搅拌条件下,将制得的有机相分散于水相中,低温固化后,得RD纳米混悬液A,简称RD-NA。微射流制备方法如下：将RD和稳定剂在搅拌条件下分散于水中,超声分散后制得粗混悬剂,将粗混悬剂通过高速剪切机15000转／分钟剪切1分钟后,经高压微射流纳米分散仪,以2000 bar压力下均质8次,得RD纳米结晶混悬液B,简称RD-NB。两种制备方法工艺操作简单,重现性良好,透射电镜下观察所得的RD纳米结晶为颗粒状结晶,表面不粘连,粒径分布较窄,平均粒径分别为184.10±3.15nm和815.37+9.65 nm,Zeta电位分别为-27.89±0.84mV和-17.43+0.76 mV。为进一步对提高所制备的纳米混悬剂的稳定性,采用冷冻干燥技术,将RD胶体混悬液制成冻干粉针剂。其冻干工艺：经优化工艺制备的RD纳米混悬液加入5%甘露醇作为支架剂,振摇溶解,分装于15mL西林瓶中,置于-80℃的超低温冰箱中冷冻48 h,取出后迅速转移至冷冻干燥机中,于-50℃真空条件下冻干48 h,即得RD的冻干品。质量评价结果表明冻干过程对药物的粒径和Zeta电位影响较小。对冻干品的DSC和XRD分析结果表明,制成纳米混悬液后,药物纳米粒子仍维持原有的晶型结构。以RD冻干粉的外观、再分散性、粒径和Zeta电位等为指标,评价了RD冻干粉的初步稳定性,结果显示RD冻干粉在4℃冷藏条件下放置一个月,其物理化学稳定性良好。RD纳米混悬剂冻干粉的饱和溶解度结果表明,将RD制备成纳米混悬剂后,其溶解度由0.619±0.245 μg/mL提高到了222.1±10.5μg,mL和30.5±2.1μg/mL;通过浆法对RD冻干粉的体外溶出进行考察,结果表明,与原料药相比,纳米冻干粉末大大提高了RD的溶出速率。本文采用HPLC法,研究了小鼠尾静脉注射RD溶液剂(RD-S01)、RD纳米混悬液A(RD-NA)和RD纳米混悬液B(RD-NB)后药物在体内的组织分布情况。RD-NB与RD-Sol和RD-NA相比,显著提高了药物在肺中的浓度水平,并延长了药物在体内的滞留时间。因此,RD-NB能够使羽苔素靶向浓集于肺中,从而可能提高羽苔素的治疗效果,具有重要的潜在临床价值。大鼠体内的药物动力学研究结果表明RD-NA与RD-Sol的药动学参数相似,但与RD-NB的血药浓度-时间曲线有显著不同。三种制剂均按注射RD 80 mg/kg计,静脉注射RD-Sol后,大鼠体内清除率CLz为4.2 L·h-1·Kg-1,平均滞留时间MRT为2.75h, AUC为16.7 h·μgmL-1;与其相似的是注射RD-NA后,CLz为4.245 L·h-1-Kg-1,MRT为2.183 h,AUC为17.35 h·μg·mL。而静脉注射RRD-NB后,平均滞留时间MRT有所延长,清除率则显著下降,MRT为4.277 h,CLz为1.717 L·h-1·Kg-1, AUC为45.95h·μg·mL-1,约为另外两组的3倍。以RD为模型药物制备纳米混悬液的研究,是RD药物临床前药学评价的一部分,为临床应用奠定了基础,为难溶性药物注射剂的开发提供了思路,并对治疗肺癌疾病药物注射剂的临床开发应用有重要的意义。为了提高药物制剂对特定靶点的靶向性,延长药物在体内的半衰期,提高药物的生物利用度,本课题进行了第二部分的实验研究。本第二部分,以第一部分研究内容为基础,制备了多功能自组装胶束。自组装聚合物纳米胶束具有较高的热力学稳定性,内核可以作为疏水性药物RD的储库,亲水性外壳PEG具有延长体内循环时间的作用,并可以通过化学修饰实现叶酸进行主动靶向、聚(p-氨基酯)响应微环境(pH敏感)、PEG修饰逃避单核细胞的吞噬等目的,因此自组装聚合物纳米胶束在药物递送方面具有重大潜力,受到越来越多药学工作者的关注。首先,用疏水性的脱氧胆酸(DOCA)修饰O-羧甲基壳聚糖(OCMC),制备两亲性的聚合物骨架DOMC,然后与叶酸(FA)和聚(p-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)偶联,开发一种新型的具有主动肿瘤靶向作用的药物传输系统。通过红外光谱法(IR)、核磁共振波谱法(NMR-1H)分析了聚合物的结构特征,证明脱氧胆酸、叶酸以及PEG-PAE成功的接枝到O-羧甲基壳聚糖上。通过粒径测定、Zeta电势、透射电镜等方法研究了聚合物在水溶液中的自聚集的理化性质。在pH7.4的磷酸缓冲盐溶液中,DOMC-FA和P EG-PAE-DOMC-FA自聚物粒径小,且具有窄的粒径分布；在pH5.0的磷酸缓冲液溶液中,自聚物的粒径均明显变大。透射电镜中自聚物的形态为球形。DOMC-FA自聚集体的Zeta电势在-20 mV左右,其表面被带负电荷的O-羧甲基壳聚糖覆盖。PEG-PAE-DOMC-FA的Zeta电位约为-4mV左右,这是由于PAE-PEG在pH5.0时基团带有正电荷的原因。与粒径和电位的结果一样,临界胶束浓度也随着pH的变化而有所变化。溶血性实验确保了两种胶束动物实验的安全性。构建和表征了以自组装法制备的载药纳米胶束。制备的DOMC-FA/RD和PEG-PAE-DOMC-FA/RD纳米胶束在pH7.4时的载药量分别为22.78%和32.27%,包封率高达45.57%和64.53%,胶束的平均粒径分别为153.6nm和210.5 nm,粒径分布的范围均较窄(PDI<0.25)。所制备纳米胶束的Zeta电势值均为负值,大约为-20mV,说明纳米胶束的表面被羧甲基壳聚糖带负电的羧基所覆盖。而在pH5.0时,两种胶束的载药量和包封率均降低,且粒径明显变大,胶束结构发生变化。纳米胶束室温放置3个月后,其外观、粒径和包封率均无较大的改变；而在4-C冷藏条件下放置6个月后,外观、粒径和包封率略有变化,但仍符合要求,说明载药纳米胶束具有较好的稳定性。体外释放试验中,PEG-PAE-DOMC-FA/RD纳米胶束在pH7.4时的累积释药表现出明显的缓释作用。最重要的是,药物从胶束中的释放呈现一定的pH依赖性。从而进一步提示,该纳米胶束载体系统能够在肿瘤部位pH依赖性的持续释放药物,对抗肿瘤治疗具有潜在价值。为了研究叶酸靶向胶束被叶酸受体表达细胞的摄取,MCF-7细胞用香豆素-6溶液、载香豆素-6的DOMC-FA胶束溶液、载香豆素-6的PEG-PAE-DOMC-FA/RD胶束溶液培养不同的时间。结果表明,由于叶酸受体介导的胞吞作用的增强,两种接枝FA的纳米胶束摄取量均增高。MCF-7细胞的MTT试验、凋亡试验证实叶酸修饰的胶束可通过叶酸介导的细胞内摄作用增强肿瘤细胞的杀伤效果,而PEG-PAE继续修饰会增强杀伤效果。载RD的pH敏感型叶酸介导胶束(PEG-PAE-DOMC-FA/RD)比叶酸介导胶束(DOMC-FA/RD)和自制的RD溶液表现出更强的肿瘤细胞毒性。这些结果说明,叶酸修饰的聚合物胶束可靶向输送RD到肿瘤细胞内,而PEG-PAE基团带正电荷增强了对肿瘤细胞的靶向作用,并可降低抗癌药物的毒副作用,在实体肿瘤的治疗方面具有潜在应用价值。小鼠体内组织分布研究表明,小鼠尾静脉注射RD-Sol、DOMC-FA/RD和PEG-PAE-DOMC-FA/RD胶束后药物在各组织器官的分布发生了改变。结果表明RD制成PEG-PAE-DOMC-FA/RD胶束后可明显延长药物在体内的平均滞留时间,具有明显缓释效应,有助于提高药物的疗效。靶向性评价结果显示,与RD-Sol注射液相比,RD制成PEG-PAE-DOMC-FA/RD胶束后体内行为发生了明显改变,相对摄取率re从高到低依次为血3.79、肺1.33、肝0.80、肾0.65、脾0.42、心0.38,明显在血液中滞留。一般化疗药物的主要毒性在于心脏毒性和肾毒性,PEG-PAE-DOMC-FA/RD胶束降低了RD在心、肾的分布,减少了对心脏和肾脏的毒性,从而对临床应用具有重要意义。药物动力学研究结果表明,RD-Sol和DOMC-FA/RD胶束注射后其t1/2β相似,而PEG-PAE-DOMC-FA/RD的t1/2β提高了近10倍。RD-Sol和DOMC-FA/RD的AUC(0-∞)分别为36.1 mg/L-h和34.5mg/L.h,而PEG-PAE-DOMC-FA/RD的AUC(0-∞)为123.8 mg/L-h,明显高于前两组制剂。而三种制剂中RD的清除率分别是1.108、1.159和0.323 L/h/kg,且PEG-PAE-DOMC-FA/RD制剂中RD的MRT平均滞留时间最长。因此,RD制备成PEG包裹的纳米胶束制剂后可以显著延长药物在小鼠体内的循环时间,有助于提高RD的抗癌效果。采用动物移植性肿瘤的实验方法,将人源性MCF-7细胞接种于裸鼠皮下,进行体内抑瘤实验,结果表明,在相同药物剂量时,RD溶液组的抗肿瘤活性最差,PEG-PAE-DOMC-FA/RD和DOMC-FA/RD的抑瘤率均有提高,且PEG-PAE-DOMC-FA/RD的抑瘤效果更明显。给药过程中,所有制剂组动物均未有明显体重变化,证明几种制剂在给药剂量下体内毒性均较小。第二部分研究选用具有环境pH敏感型智能聚合物材料作为抗肿瘤药物RD的载体,首次同时将具有pH敏感性的PAE-PEG和主动靶向的叶酸接枝在载体材料中,制备了同时兼备pH敏感性和主动靶向性的纳米胶束给药体系,以实现抗肿瘤药物的对癌症部位的靶向输送,并提高了药物在体内的半衰期和生物利用度。全文的研究成果为新化学实体riccardin D的进一步临床应用提供了实验依据和理论基础,为抗肿瘤药物靶向给药系统的开发提供了思路。