小麦(Triticum aestivum,2n=6x=42,AABBDD)是我国重要的粮食作物。百萨偃麦草(2n=2x=14,JJ)具有很强的耐盐性和抗多种小麦病害,是小麦改良的重要基因资源。染色体工程是小麦改良的有效途径,然而由于传统荧光原位杂交(FISH)所用的质粒探针数目有限,制备程序繁琐、成本高,因此限制了染色体工程效率的提高。寡核苷酸(single strand oligonucleotide,SSON)探针是人工合成的一种带有荧光集团的单链DNA或RNA片段,其长度通常为20～60 nt,具有易设计、合成和修饰,成本低、灵敏度高、重复性好等特点。基于寡核苷酸探针的寡核苷酸FISH技术省去了传统FISH制备探针必需的质粒引进、繁殖、提取、标记或PCR扩增等程序,具有简单、经济和高效的特点,是新一代染色体鉴定技术,具有很大的研究和应用潜力。(1)通过探针长度和浓度效应分析,发现29～59 nt比14～15 nt SSON探针在低浓度下更容易产生清晰稳定的信号,据此建立了利用已知重复序列、小麦染色体3B和百萨偃麦草染色体4JL基因组序列开发重复序列SSON探针的方法:在王艳芝(2013)将广泛应用的已知重复序列pSc119.2和pAs1开发成8个56～59 nt SSON基础上,新开发16个小麦和百萨偃麦草SSON探针用于染色体鉴定,其中4个(DP4J24903、DP4J27982、DP4J31304 和 DP4J28086)为百萨偃麦草基因组专化探针,1个(3K-5)为染色体3B专化探针;研究发现,这些SSON探针均可以进行FISH或非变性FISH(ND-FISH),但均以FISH信号更多、效果更稳定;还发现 SSON 探针(GAA)10,(AAC)10 和 pSc119.2-1 可以分别在 0.01 ng/μl,0.01 ng/μl和0.2 ng/μl浓度和非变性条件下高效涂染小麦和黑麦染色体,据此开发了可以循环利用的寡核苷酸染液,为染色体自动化分析及基于不同荧光信号强度进行染色体分拣提供了有力工具。(2)根据单个SSON的杂交信号特征,组配出4个寡核苷酸探针套,通过一次FISH,用于清晰区分小麦、黑麦和百萨偃麦草全部染色体鉴定,建立了简单、经济和高效的染色体鉴定方法,其中multiplex#1和multiple x#4在杂交信号更丰富,易于根据不同颜色和信号强度准确识别小麦不同基因组和全部染色体;利用multiplex#1和multiplex#4建立了中国春和百萨偃麦草高清核型,并用于分析栽培小麦染色体多样性和中国春-百萨偃麦草异染色体系染色体组成;其中,利用multiplex#1和DP4J27982,准确鉴定了三个染色体代换系和五个易位系,明确了百萨偃麦草与普通小麦染色体部分同源性;利用multiplex#4通过一次FISH分析,可以清晰识别全部小麦染色体及其8个栽培品种(系)的染色体多态性,其中B基因组染色体变异最多,其次为A,最后为D。(3)花生(Arachis hypogaea,2n=4x=40,AABB)我国重要的油料和经济作物。然而由于花生核型清晰度低,花生属野生种基因组识别和分类困难,影响花生染色体工程进展。本研究利用SSR、端粒重复序列和4GbA.duranensis基因组序列,开发出7个花生SSON探针,信号主要分布在染色体末端、臂中和着丝粒区,据此组配出两个寡核苷酸探针套multiplex#5和multiplex#6用于区分花生全部染色体。综合SSON、45S rDNA、5S rDNA、A.duranensis基因组和A.ipaensis基因组探针顺序FISH分析,构建了栽培种花生和野生种高分辨率晰核型,可以识别9个物种的全部染色体,为花生基因组分类和染色体研究提供了新工具。发现花生野生种染色体存在多种变异,如同源染色体rDNA位点杂合、染色体倒位和重复序列扩增等,揭示花生物种演化过程中发生了复杂的染色体重排。(4)由于花生遗传研究相对薄弱,迄今尚未实现遗传图、序列图和实际染色体的完全对应,本文利用A.duranensis A6染色体基因组序列图短臂末端0-8.5 Mb区域的特异基因序列,设计了一个包含20000条42～48 nt SSON的寡核苷酸库6A-1,通过综合利用45S、5S rDNA和SSON DP-5顺序FISH,发现6A-1在细胞学核型中A3染色体上产生预期的清晰的杂交信号,首次将花生A6染色体序列图与花生实际染色体A3进行了对应,为建立花生基因组序列图与全部实际染色体的对应提供了可能。