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甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物,因其重要的生理活性,临床上具有广泛的应用。雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）是重要甾体药物中间体,可通过结构上的化学修饰合成几乎所有的甾体类药物,在甾体药物行业中的地位日益突出。然而由于底物投料浓度低,发酵转化周期长及甾体微生物代谢机理认知的不足等问题,我国在甾体微生物转化生产上仍明显落后于欧美等国家,这严重制约了我国甾体药物产业绿色转型的步伐。因此,本论文以甾醇转化过程关键酶为目标,对新金色分枝杆菌Myobacterium neoaurum转化植物甾醇合成ADD过程中的关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KSDD）,胆固醇氧化酶（Cho M）,甾酮C27单加氧酶（SMO）和3-甾酮-9α-羟化酶（KSH）进行研究,利用代谢工程策略,实现了ADD的高效积累。此外,本研究对甾醇代谢产物进行了拓展,将来源于人体中AD合成睾酮（TS）的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了甾体药物TS的生物学合成。主要内容总结如下:1.课题组前期对M.neoaurum ST-095进行诱变获得菌株M.neoaurum JC-12,其转化植物甾醇合成AD和ADD的总产量相同但摩尔比例不同,推测原因是催化AD到ADD的KSDD活性差异所导致。因此,本研究通过对诱变前后菌株KSDD氨基酸序列比对,发现M.neoaurum ST-095中KSDDI和M.neoaurum JC-12中KSDDII的不同在于氨基酸序列V366S的突变,该突变直接影响了KSDD活性。枯草芽孢杆菌中异源表达和酶动力学分析表明V366S的突变使得KSDD对底物的亲和性和催化效率提高进而明显提高酶活性。对KSDDI和KSDDII在新金色分枝杆菌中的功能进行分析,证实该突变是引起菌株诱变前后产生不同AD和ADD摩尔比的原因。进一步对KSDD催化活性中心结构分析,发现V366S的突变能够减少底物与酶催化中心的空间位阻提高了KSDD的催化活性和稳定性,进而提高其酶活性。2.将M.neoaurum JC-12中的Cho M1和Cho M2基因在枯草芽孢杆菌中进行异源表达,对其酶学性质进行研究,结果表明重组Cho M1和Cho M2的反应最适p H和温度均分别为7.5和37°C,Mg2+和Mn2+能够明显促进其酶活性。动力学参数表明,和Cho M1相比,Cho M2对底物的亲和力更强,从而表现出更高的酶活性。利用构建的重组菌B.subtilis 168/p MA5-cho M1和B.subtilis 168/p MA5-cho M2全细胞实现了胆固醇到4-胆甾烯-3-酮的转化,24 h后产量分别为0.67 g·L-1和0.83 g·L-1。将Cho M2在M.neoaurum JC-12中过量表达以提高底物甾醇的摄取和转化能力,最终ADD产量达到4.73 g·L-1,提高了37.1%。结果表明可以通过提高甾醇转化菌株中Cho M活性来改良菌种的发酵特性,实现甾醇的高效转化。3.鉴定了来源于新金色分枝杆菌的三个SMO同工酶SMO1,SMO2和SMO3具有甾醇侧链末端氧化功能。对其进行异源表达与纯化,酶动力学分析表明SMO2对底物亲和性更强,催化效率更高。对三个同工酶基因的敲除和功能回补进行研究,发现缺陷菌株对底物甾醇的代谢速率受到明显的抑制作用,证实了SMO是分枝杆菌甾醇侧链转化第一步反应的关键酶,其中SMO2在甾醇代谢过程中作用最为明显。在M.neoaurum JC-12中分别过表达SMO1,SMO2和SMO3,考察过量表达SMO对菌株在甾醇转化能力上的影响。结果表明SMO1,SMO2和SMO3过表达菌株ADD的产量分别从3.48 g·L-1提高到4.49 g·L-1,4.96 g·L-1和4.13 g·L-1,分别提高了29.0%,42.5%和18.7%,其中SMO2在提高ADD产量上效果最为明显。结果表明可以通过提高SMO的酶活性来提高菌株转化甾醇合成ADD的能力。4.利用代谢工程手段调控M.neoaurum JC-12转化甾醇合成ADD的代谢途径。首先敲除ksh A1基因使得KSH活性缺失,从而阻断了ADD降解途径,ADD产量从3.45g·L-1提高到4.57 g·L-1,并且发酵后期ADD不再被降解。在KSH活性缺失的基础上,通过共表达代谢途径中的关键酶Cho M2,SMO2和KSDD提高甾醇代谢途径中的代谢通量,最终获得高效转化植物甾醇合成ADD的重组菌JC-12S2-cho M2-ksdd。以20 g·L-1植物甾醇作为底物进行发酵转化168 h,重组菌ADD的产量从6.55 g·L-1提高到12.40 g·L-1,提高了89.3%。为了缩短发酵周期,提高ADD的生产效率,本研究在5-L发酵罐上对重组菌株的发酵工艺进行优化。以果糖作为初始碳源,明显消除重组菌生长延滞期,然后结合多阶段发酵策略,最终180 h获得20.1 g·L-1的ADD,生产效率从0.074 g·（L·h）-1提高到0.112 g·（L·h）-1。这是目前文献报道中利用甾醇转化合成ADD的最高产量。同时发酵工艺技术手段具有广泛的通用性和突出的应用价值,理应得到大力推广。5.论文对甾体药物及中间体睾酮（TS）的微生物合成进行了初步研究。首先将来源于人体中AD合成TS的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了TS的生物学合成。将经密码子优化后的人体17β-羟基类固醇脱氢酶3（17β-HSD3）基因在毕赤酵母中进行了异源活性表达,验证了其具有催化AD合成TS的功能,并且该催化反应为不可逆反应。然后在毕赤酵母中共表达17β-HSD3和酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）构建NADPH辅酶循环再生系统。以葡萄糖为辅底物,重组菌P.pastoris/17β-HSD3P-G6PDH全细胞能够高效转化AD合成TS。进一步优化其全细胞转化条件:温度为37°C,p H为7.5,底物最佳助溶剂为Me-β-CD,最适菌体生物量为200 g·L-1（湿重）,最适底物浓度为5 g·L-1。在5-L发酵罐上利用分批补料策略转化120 h,TS的终产量达到11.6 g·L-1,这是目前文献报道中微生物法转化合成TS的最高产量。结果表明毕赤酵母系统共表达目的酶蛋白和辅酶循环再生酶系可以作为合成其他甾体药物的有效途径。为实现由植物甾醇一步转化合成TS,将密码子优化后的17β-hsd3基因转化到高产AD的M.neoaurum ZADF-4中。然而遗憾的是,虽然表达出17β-HSD3目的蛋白,但是没有酶活性,并且重组菌也不能够转化植物甾醇合成TS。