论文部分内容阅读
目的：建立一种简单易行的分离未成年小鼠卵巢卵泡膜间质细胞的方法，并对分离细胞进行培养和功能鉴定。方法：选取未成年C57BL/6小鼠（21-25d）的卵巢组织，在体式显微镜下分离干净周围组织并去包膜，用机械法去除颗粒细胞，将残余组织在LSP培养基清洗两次后用胶原酶Ⅳ-DNase（4g/L胶原酶，10g／LDNase和10g/L BSA溶于M199培养液）在37℃,5%CO2培养箱中消化分离卵泡膜间质细胞，用含10%胎牛血清及10ng/ml雄激素的McCoy’s5a培养基进行培养，并用免疫细胞化学技术、蛋白印迹技术、激素检测对培养的卵泡膜间质细胞进行鉴定。通过卵泡膜-间质细胞在不同浓度的FSH和LH条件下激素水平的改变，检测该细胞激素分泌反应性。结果：通过上述分离方法得到的细胞存活率在90%以上，细胞在培养24小时内贴壁生长，细胞贴壁生长成梭形和不规则三角形，且能在含10%胎牛血清及10ng/ml雄激素McCoy’s5a培养基中分裂增殖。免疫细胞化学结果显示贴壁生长细胞AMH蛋白阳性表达<5%，而p450scc蛋呈阳性表达>95%；贴壁细胞培养24小时之后雄激素浓度为649.22±12.3ng/dl(n=3),雌激素浓度<10.7pg/ml(n=3);0.1U/ml LH组的睾酮水平明显高于FSH组和基础培养基组（p<0.05）。0.5U/ml LH组的睾酮水平显著高于0.1U/ml组差异均有统计学意义（P<0.05）；加入LH0.5U/ml组、1U/ml组，2U/ml组之间睾酮水平未见明显统计学意义(P>0.05)。FSH组睾酮水平和基础培养基组未见明显统计学差异(p>0.05)，在这三组中均未检测到雌激素水平的改变。结论：通过本实验的分离和培养方法可以得到大量贴壁生长的卵泡膜间质细胞，其中很少有颗粒细胞的混杂，此方法可以快速、高效的进行小鼠卵泡膜间质细胞的分离培养。