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植物钙调素(CaM)的多基因家族编码了多种钙调素亚型，它们在生化特性、组织分布及生物学功能等方面均表现出了各自的特性。通过对不同亚型CaM的亚细胞定位，可以了解生物体中存在不同亚型CaM的意义，并在此基础上研究不同亚型CaM在植物的生长发育过程中的作用及调节机制。本文设计实验拟制备抗大豆2号亚型CaM(SCaM-2)的单克隆抗体(mAb)并对其性质及功能进行研究，以期为定位研究打下基础。
首先将含有pSCaM-2质粒pET-28b(+)的大肠杆菌BL21进行培养，IPTG诱导蛋白的表达，通过Phenyl-Sepharose4B疏水亲和层析柱提取纯化SCaM-2，经SDS-PAGE证明是一条带，可作为制备单克隆抗体的抗原材料。
用纯化的SCaM-2免疫BALB/c小鼠，将免疫鼠脾细胞和小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经ELISA法多次筛选和有限稀释再克隆化，最终建立10株稳定分泌抗SCaM-2单克隆抗体的杂交瘤细胞。检测杂交瘤细胞培养上清液与各亚型SCaMs的交叉反应，从中选取3株杂交瘤细胞免疫小鼠制备腹水抗体。经检测腹水抗体效价为10-4～10-5。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水单克隆抗体。采用间接ELISA分析单克隆抗体特异性，结果表明三株单克隆抗体(分别命名为6F11F3、7C5E9和7E10E2)在高稀释度时分别与SCaM-1、SCaM-2、SCaM-4、SCaM-5出现特异反应：6F11F3稀释至1：32000只识别SCaM-1、SCaM-2，7C5E9稀释至1：64000只与SCaM-4出现特异性反应，7E10E2稀释至1：32000只与SCaM-5出现特异性反应。免疫印迹实验也表明，在高稀释度时，6F11F3识别SCaM-1、SCaM-2，而7C5E9和7E10E2分别只与SCaM-4、SCaM-5出现特异性反应。通过免疫双扩散法，对三株单克隆抗体作Ig亚类鉴定，结果显示6F11F3、7C5E9为IgG2a亚型，7E10E2为IgG1亚型。相加实验结果显示，6F11F3、7C5E9可能识别SCaM-2相同的抗原表位，而7E10E2可能识别不同的抗原表位。用非竞争ELISA法测定三株单克隆抗体的亲和常数，结果6F11F3对SCaM-2的亲和常数Ka为2.127±0.418×106M-1，7C5E9对SCaM-4的亲和常数Ka为9.69±2.406×106M-1，7E10E2对SCaM-5的亲和常数Ka为1.203±0.429×107M-1。结论：本课题制备的三株单克隆抗体中，6F11F3可作为识别SCaM-1、SCaM-2的抗体用于研究，7C5E9和7E10E2在高稀释度时可分别作为抗SCaM-4、SCaM-5的特异单克隆抗体用于定位研究。