大量研究证实铁蛋白(FTH1)表达变化与肝炎密切相关。本课题组前期通过抑制性消减杂交技术也发现,FTH1为雏鸭肝炎病毒侵染过程中表达下调的关键候选基因,对FTH1基因编码区进行了测序分析,发现该基因的编码区在雏鸭肝炎病毒(DHV-1)感染发病、未发病和对照组不同个体间仅发现有一处同义突变,其余未发生任何有义突变、缺失或重排。为了进一步揭示鸭FTH1基因转录水平的调控机制,本研究主要开展了如下工作：1.运用基因组步移扩增,成功获得了duFTH1基因ATG上游-1110 bp,并通过在线预测5’侧翼序列含有一个典型的CpG岛,同时还发现duFTH1基因的转录起始点附近存在Sp-1等多个转录因子结合位点反式作用元件,且这些反式作用元件还位于CG二核苷酸位点上。BSP检测结果显示,鸭血液、脾脏组织中duFTH1基因启动子区的CpG岛处于低甲基化状态,且发现DHV-1病毒感染后发病、未发病和对照组血液duFTH1基因的甲基化程度均处于低甲基化状态。2.通过制备一系列启动子缺失突变体：pGL3-Basic-M1(+145～-765)、pGL3-Basic-M2 (+145～486)、pGL3-Basic-M3(+145～-265)、GL3-Basic-M4(+145～-144)、pGL3-Basic-M5 (+145～-35)、pGL3-Basic-M6(+145～-11)和pGL3-Basic-M7(+145～+50),双荧光素酶报告基因显示在表达载体pGL3-M4和pGL3-M5(-144 bp/-35 bp)之间存在重要的作用元件,对启动子活性具有影响。对DHV-1病毒感染后发病、未发病组duFTH1基因启动子转录活性区(-144 bp/-35 bp)序列进行了SNP筛查,发现在DHV-1不同处理组间仅存在1处碱基突变(-54 C>T),alibaba2和jaspar软件在线预测该突变位点还影响到转录因子NRF1结合。3.为证实该SNP位点(-54 C>T)的作用机制,对duFTH1基因核心启动子区可能存在的转录因子NRF1结合位点进行了定点突变,双荧光素酶报告基因显示：突变重组质粒(-54 T)荧光素酶活性极显著高于未突变重组质粒(-54 C)(P<0.01)。为进一步验证该位点的作用,继续开展了凝胶电泳阻滞迁移分析(EMSA),结果显示：转录因子NRF1与duFTH1基因启动子区序列能够结合,而位点-54 C>T突变明显减弱了结合条带,竞争性实验及超凝胶阻滞实验更进一步证实了结合的特异性。由上可知,duFTH1基因转录不受其启动子区甲基修饰调控,而受核心启动子区-144bp/-35 bp内的-54 C>T突变影响。