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目的利用慢病毒载体通过正反两方面调控Islet-1(Insulin gene enhancer binding protein-1,胰岛素增强结合因子)蛋白的表达来探讨Islet-1因子在C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用;明确这种作用是否为心肌特异性。材料与方法1. Islet-1慢病毒表达载体的构建:利用PCR方法钓取Islet-1基因,将其与pLenO-WPI载体分别进行双酶切。纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,其上下游引物分别设计在载体和目的基因上,PCR鉴定为阳性的克隆,证明Islet-1基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体。2. Islet-1慢病毒干扰载体的构建:针对小鼠Islet-1基因设计3个RNA干扰(RNAi)靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠杆菌进行扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体。3.慢病毒载体感染C3H10T1/2细胞:将生长至密度为60%的C3H10T1/2细胞按Moi=20加入相应量的病毒,同时加入Polybrene至其总浓度达8mg/L。以实时荧光定量PCR(Real-Time fluorescent quantitative PCR RT-QPCR)及蛋白质免疫印迹(Western-blot)检测Islet-1的表达。4. Islet-1正反向干预实验:本实验分两部分,从正(Islet-1表达)反(Islet-1干扰)两方面进行。分别分为三组:原始对照组(C3H10T1/2细胞)、空白对照组(空载体组)及实验组(两部分分别为Islet-1表达组和Islet-1干扰组)。感染慢病毒后以实时荧光定量PCR检测心肌细胞早期转录因子MEF-2c、GATA-4及NKx2.5。以Western-blot及免疫荧光检测心肌特异性蛋白心肌肌钙蛋白T(cardiac muscle Troponin T cTnT)。同时检测肝脏系统特异性标志AFP(Alpha Fetoprotein,甲胎蛋白)及ALB(albumin,白蛋白)、骨骼系统特异性标志BGP(BoneGlaprotein,骨钙素)及BALP(Bone alkaline phosphatase,骨碱性磷酸酶)、神经系统特异性标志Nestin (巢蛋白)、NSE(neuron-specific enolase,神经元特异性烯醇化酶)GFAP(glial fibrillary acidic protein,神经胶质纤维酸性蛋白),方法同上。结果1.酶切后PCR鉴定得出片段大小为2400bp左右,为阳性克隆,测序并与克隆模板比对结果显示阳性克隆插入片段正确。2. Islet-1三个靶点重组载体阳性克隆的PCR鉴定MluI、XbaI位点两个酶切位点插入目标序列后片段大小应为330bp。阳性克隆经测序比对分析显示已插入目的片段。3.慢病毒感染目的细胞后3天后可观测到绿色荧光蛋白(GFP)的表达;实时荧光定量PCR显示表达载体组Islet-1基因的表达比空白对照组高(P<0.05),干扰载体组Islet-1基因的表达比空白对照组低(P<0.05);Western-blot显示表达载体组出现Islet-1蛋白表达,干扰载体组与空白对照组一样未出现Islet-1蛋白表达。4. Islet-1正反向干预实验:正向(Islet-1表达)实验的实时荧光定量PCR显示心肌细胞早期转录因子MEF-2c、GATA-4及NKx2.5在感染Islet-1表达病毒载体后出现表达,Western-blot检测出现cTnT的表达,免疫荧光显示cTnT表达于胞浆;反向实验的实时荧光定量PCR检测心肌发育相关基因MEF-2c GATA-4和NKx2.5干扰组与对照组相比没有统计学意义,Western-blot检测未检测到cTnT的表达;肝脏、骨骼及神经系统标志基因与对照组相比,无明显改变,肝脏,骨骼特异性蛋白未见表达,神经系统特异性蛋白GFAP未见表达、NSE在对照组与实验组均表达,表达量无明显差异。结论1. Islet-1因子可促进C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化,开启了心肌早期发育相关基因,并导致心肌特异性蛋白的表达。2. Islet-1因子的作用具有心肌组织特异性。