无细胞系统原位制备蛋白质芯片及新型离子液体修饰电极的制备

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蛋白质微阵列具有高通量、微型化、集成化等特点,因而常用于蛋白质组学研究中对于生物化学和分子生物学的多元化和平行化检验。传统的蛋白质微阵列需要通过基因克隆、表达、纯化、点样等步骤,程序繁琐、费时费力、成本较高,已成为蛋白质芯片技术发展的瓶颈。为解决这些难题,我们设计了一种新方法,先将PCR扩增的基因固定在基底芯片上,再利用无细胞蛋白质合成系统将其转变成蛋白质微阵列。这种生物素标记的DNA和生物素标记的抗GST抗体可以与预先固定在醛基玻片上的链亲和素结合而固定在芯片上。以无细胞蛋白质合成系统孵育后,原位无细胞合成的GST标签蛋白被抗GST标签抗体捕获而固定在芯片上。然后对蛋白质进行进一步纯化,并用探针检测,同时对蛋白质活性进行了研究并进行初步定量分析,初步估算12个基因表达的蛋白质产量在0.35 ~ 4.0 fmol/点之间。考察了利用酪胺信号放大技术(TSA)检测的效果。本文以鼠IgG为研究对象,对TSA技术进行了考察,与传统荧光检测相比,TSA技术对鼠IgG的检测限提高约100倍。室温离子液体(RTILs)具有特殊的理化性质,在电分析化学领域它既可以作为溶剂和支持电解质,又可以作为粘合剂和固定材料用于制备修饰电极。本文利用两种不同性质的离子液体制备了修饰电极,研究内容如下:1以1-乙基3-甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)为粘合剂制备离子液体碳糊电极(CILE),并以此为基底电极在亚甲基蓝单体溶液中电化学聚合制备了聚亚甲基蓝膜修饰电极,研究了聚亚甲基蓝膜修饰电极的形貌并对其进行了表征。同时研究了其对酚类化合物3,4-二羟基苯甲酸的电催化行为,其催化的峰电流与3,4-二羟基苯甲酸的浓度在5.0×10-4 ~ 3.0×10-2 mol/L呈线性关系,检测限为1.72×10-4 mol/L (3σ)。2将室温离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)和Nafion混合后形成一种新型的复合膜材料,利用该膜材料将Mb固定于传统碳糊电极(CPE)上,详细考察了Mb在Nafion-BMIMPF6复合膜中的电化学行为。结果表明循环伏安扫描出现一对峰形良好且准可逆的氧化还原峰,为Mb Fe(III)/Fe(II)的特征峰,求解了相关的电化学参数。该修饰电极对三氯乙酸表现出较好的电催化性能,其催化的还原峰电流与三氯乙酸的浓度在2.0×10-4 ~ 1.1×10-2 mol/L范围内呈线性关系,检测限为1.6×10-5 mol/L (3σ)。
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