青椒(Capsicum annuum L.),又名甜椒,辣椒属,原产于南美洲热带地区,因其味道甜而不辣果肉肥厚,所以深受人们的喜爱。青椒果实内含有丰富的维生素C、维生素A以及酚类物质,因此具有较高的食用价值和经济价值,其年消费总量在全世界范围内居高不下。一直以来,低温贮藏和运输是保持青椒果实品质并延长货架期的主要手段,但由于青椒果实对低温较为敏感,在低温环境下,尤其在0-7℃间极易出现种籽和花萼褐变、果皮凹陷等冷害症状,严重影响了青椒的商品品质和商品价值。鉴于此,研究低温下青椒的冷害机理、探索相应的调控技术,具有重要的理论和实践意义。本文首先通过对青椒形态和生理生化指标观察与分析,研究低温胁迫下青椒冷害的发生与相关指标的变化规律,然后通过转录组测序,全面分析发生冷害与未发生冷害的青椒果实的差异表达基因和转录因子,并进行生物信息学分析,挖掘差异基因参与的代谢途径,在此基础上,聚焦膜脂代谢的关键结构基因,筛选关键转录因子,借助酵母单杂交、凝胶迁移、β-葡萄糖苷酸酶活性分析试验等分子生物学技术研究转录因子对关键基因的转录调控机理。基于上述机理研究探讨调控技术对低温下青椒冷害的调控作用及其作用机理。该研究结果将为其他果蔬冷害机理研究提供参考,为研发青椒冷害的调控技术提供理论依据。主要结果如下:在4℃和10℃条件下贮藏的青椒,其表观、果肉组织的解剖结构、细胞结构、水分分布,以及膜脂组分与膜脂代谢相关酶活性等的变化有所不同。结果表明:4℃贮藏的青椒果实出现了冷害症状,表现为细胞膜严重损伤、细胞器普遍瓦解、水分匮缺明显;此外,相对电导率、丙二醛、脯氨酸含量随着贮藏时间的延长而升高,膜脂含量大幅降解,其中脂质分子单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)对低温响应显著,不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸比例伴随时间的延长呈降低趋势,而饱和脂肪酸棕榈酸、硬脂酸比例则不断增加;同时磷脂酶D(PLD)和脂氧合酶(LOX)活性在4℃下显著高于10℃,这些结果证实低温胁迫下PLD和LOX酶被激活从而参与了膜脂代谢路径改变了膜脂的组成和细胞膜性质,触发了膜脂的降解和过氧化,导致胞内活性氧代谢失调进而引发系列的次级代谢反应,导致了青椒冷害。通过转录组测序技术(RNA-Seq)对采后当天、4℃和10℃下贮藏的青椒样品进行了转录组测序,共发掘新基因4,437个,其中3,231个基因得到功能注释。通过比较4℃和10℃两组数据,共鉴定3863个差异表达基因。GO分类结果表明这些差异表达基因主要参与“细胞过程”(cellular process)、“代谢过程”(metabolic process)、“刺激应答”(response to stimulus)、“细胞器”(organelle)、“细胞膜”(membrane)、“结合”(binding)和“核酸结合转录因子活性”(nucleic acid binding translation factor activity)。GO富集分析结果表明显著性较高的差异表达基因主要富集在“株型过敏反应”(plant-type hypersensitive response)、“质膜外部”(external side of plasma membrane)、“叶绿体类囊体膜”(chloroplast thylakoid membrane)、“蛋白结合”(protein binding)等过程。此外,KEGG代谢通路分析结果表明差异表达基因主要参与的代谢途径为“甘油脂类代谢”(glycero lipid metabolism)、“甘油磷脂代谢”(glycerophospholipid metabolism)、“脂肪酸代谢”(fatty acid metabolism)、“精氨酸与脯氨酸代谢”(arginine and proline metabolism)、“鞘糖脂生物合成-球系列”(glycosphingolipid biosynthesis-globo series)、“植物激素信号转导”(plant hormone signal transduction)和“谷胱甘肽代谢”(glutathione metabolism)。此外还鉴定了250个差异表达转录因子,包含41个家族,如AP2/ERF、MYB、NAC、C2H2和WRKY等。基于前期青椒冷害生理分析以及转录组分析结果,确定了膜脂代谢通路中关键的结构基因CaPLDα4,并鉴定了调控其转录的上游转录因子及调控模式。具体为:克隆出青椒CaPLDα4基因的上游启动子序列1.3kb,发现其序列内包含多处与非生物胁迫相关的转录因子结合位点,通过酵母单杂交、凝胶迁移以及GUS报告基因试验等技术发现NAC家族的转录因子CaNAC1可以特异性的结合CaPLDα4启动子中的顺式作用元件CTGCAG,实现彼此之间的互作进而正调控CaPLDα4基因的转录过程,参与调控磷脂的降解。此外,经鉴定CaNAC1蛋白发生了泛素化,其蛋白序列共包含7个泛素化肽段。亚细胞定位结果表明CaNAC1定位于细胞核。结构域比对分析显示CaNAC1具有保守的NAM结构域,且系统发育树结果表明CaNAC1蛋白序列与辣椒CaNAC1和拟南芥AtNTL6序列亲缘关系较高。这一结果证实CaNAC1通过靶向结合CaPLDα4的启动子中的顺式作用元件进而正调控CaPLDα4基因的转录从而参与低温胁迫下膜脂的降解。基于青椒冷害的转录调控机理研究结果,进一步探讨了褪黑素处理对青椒冷害的调控作用。结果表明:4℃下,经褪黑素处理的青椒其冷害发生时间推迟,冷害率和冷害指数均有所降低,果肉细胞较完整,细胞结构相对饱满。此外处理组青椒其相对电导率、MDA含量下降显著,而脯氨酸含量则有所提高。而且经褪黑素处理后果实细胞膜中的磷脂PC和PE降解有所减轻,且脂肪酸的不饱和度有所增加。处理组青椒其转录因子CaNAC1、CaPLD和CaLOX基因的转录水平及CaPLD和CaLOX酶活性显著降低。此外编码超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的基因CaSOD、CaPOD、CaCAT和CaAPX的表达水平在褪黑素处理后的青椒中有明显上调,这表明褪黑素处理可能通过触发青椒体内的抗氧化系统减弱了低温诱导的膜脂过氧化,因此增加了青椒对环境低温的耐受能力。