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目的：本研究拟以中药补肾和脉方干预老年自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats, SHR)，通过对其下丘脑和主动脉进行定量蛋白组测序检测，筛选并验证补肾和脉方治疗老年自发性高血压的药物作用靶点，从分子水平和网络药理学角度探究补肾和脉方治疗老年自发性高血压的作用机制，为补肾和脉方的临床应用提供客观的数据支持。
方法：
1.SPF级16月龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)20只，采用随机数字表法随机分为2组：补肾和脉方组(10只，补肾和脉方生药浓度14.22g·kg-1·d-1)和SHR模型组(10只，生理盐水2mL·d-1)，以同龄雄性WKY大鼠作为正常对照组(10只，生理盐水2mL·d-1)，共灌胃干预8周，定期观察并记录大鼠的一般生理状态和体质量，同时监测记录各组大鼠的舒张压和收缩压。8周后，大鼠观察结束，取各组大鼠的血清、下丘脑和胸主动脉。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)分别检测三组大鼠血清中神经肽(Neuropeptide Y，NPY)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)和血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的含量。HE染色观察三组大鼠下丘脑和胸主动脉的组织形态改变；
2.利用Label-free定量蛋白组学测序分析方法筛选补肾和脉方干预老年SHR后，下丘脑和主动脉蛋白质表达谱的变化，通过生物信息学对差异蛋白进行GO富集分析、并对差异蛋白的分子功能、细胞成分和生物学途径三个方面进行功能方面的注释；对差异蛋白进行KEGG通路分析得到补肾和脉方靶蛋白及其涉及的信号通路；同时建立差异蛋白的互作网络综合分析补肾和脉方的药理机制。
3.利用实时荧光定量PCR、westernblot和免疫组化分析技术验证下丘脑和主动脉中差异蛋白的表达。
结果：
1.补肾和脉方改善老年SHR的药效学研究：(1)与正常对照组WKY大鼠相比，SHR易激惹且抓取有强烈反抗行为，体质量明显较低(P＜0.05)，收缩压和舒张压均处于高水平(P＜0.05)；与SHR模型组大鼠相比，补肾和脉方干预组大鼠情绪较稳定，体质量升高(P＜0.05)，收缩压和舒张压下降(P＜0.05)。(2)主动脉HE染色显示，与正常对照组相比，SHR模型组大鼠血管壁中层平滑肌层肥厚、平滑肌细胞有明显增生，细胞核密集深染，内皮细胞排列紊乱。补肾和脉方干预后血管壁各层的细胞状态得到了明显的恢复；下丘脑HE染色显示SHR模型组大鼠下丘脑的神经元细胞为圆形或不规则形，细胞核较大且呈圆形、不规则形或分叶状，着色较浅，周围组织有明显的水肿和炎性反应发生。补肾和脉方干预后下丘脑组织形态得到了明显的恢复，周围组织的水肿和炎性反应也得到了显著的改善。(3)与正常对照组比较，SHR模型组大鼠血清NPY、NE、CRP和AngⅡ含量均处于较高水平(P＜0.05)；与SHR模型组比较，补肾和脉方组SHR的血清NPY、NE、CRP和AngⅡ的水平有明显下降(P＜0.05)。
2.Labelfree高通量定量蛋白组学测序法联合GO富集分析、信息通路富集结果和蛋白互作网络分析，筛选出差异蛋白。与老年SHR模型相比，应用补肾和脉方干预后的大鼠的下丘脑中共检出2753个差异蛋白点，其中有314个蛋白有统计学差异，其中171个蛋白表达升高，143个蛋白表达降低；差异蛋白主要富集于转运酶活性和离子通道活性方面。主动脉中共检出1769个差异蛋白，发现285个蛋白有统计学差异，其中179个蛋白表达升高，106个蛋白表达降低。差异蛋白主要富集于泛醇-细胞色素-C还原酶活性、含核碱基的化合物激酶活性、糖结合、分子内转移酶活性，磷酸转移酶和异构酶活性方面。
3.差异蛋白验证结果显示，相较于SHR模型组，补肾和脉方干预8周后补肾和脉方组大鼠的主动脉中Rab5a和SFPQ的mRNA以及蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)，而Ckm和Hist2h3c2的mRNA水平以及蛋白表达水平则明显下降(P＜0.05)；在补肾和脉方组下丘脑中Cdc42和SIRT2在mRNA和蛋白水平上表达升高(P＜0.05)，而Ptk2b的mRNA和蛋白水平表达降低(P＜0.05)。
结论：补肾和脉方一方面可能通过降低AngⅡ含量，减少MAPK通路的Ptk2b激活，延缓细胞增殖；另一方面通过MAP通路，激活Rab5a过表达，促进细胞生长，改善血管重塑，最终起到控制血压的作用。
方法：
1.SPF级16月龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)20只，采用随机数字表法随机分为2组：补肾和脉方组(10只，补肾和脉方生药浓度14.22g·kg-1·d-1)和SHR模型组(10只，生理盐水2mL·d-1)，以同龄雄性WKY大鼠作为正常对照组(10只，生理盐水2mL·d-1)，共灌胃干预8周，定期观察并记录大鼠的一般生理状态和体质量，同时监测记录各组大鼠的舒张压和收缩压。8周后，大鼠观察结束，取各组大鼠的血清、下丘脑和胸主动脉。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)分别检测三组大鼠血清中神经肽(Neuropeptide Y，NPY)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)和血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的含量。HE染色观察三组大鼠下丘脑和胸主动脉的组织形态改变；
2.利用Label-free定量蛋白组学测序分析方法筛选补肾和脉方干预老年SHR后，下丘脑和主动脉蛋白质表达谱的变化，通过生物信息学对差异蛋白进行GO富集分析、并对差异蛋白的分子功能、细胞成分和生物学途径三个方面进行功能方面的注释；对差异蛋白进行KEGG通路分析得到补肾和脉方靶蛋白及其涉及的信号通路；同时建立差异蛋白的互作网络综合分析补肾和脉方的药理机制。
3.利用实时荧光定量PCR、westernblot和免疫组化分析技术验证下丘脑和主动脉中差异蛋白的表达。
结果：
1.补肾和脉方改善老年SHR的药效学研究：(1)与正常对照组WKY大鼠相比，SHR易激惹且抓取有强烈反抗行为，体质量明显较低(P＜0.05)，收缩压和舒张压均处于高水平(P＜0.05)；与SHR模型组大鼠相比，补肾和脉方干预组大鼠情绪较稳定，体质量升高(P＜0.05)，收缩压和舒张压下降(P＜0.05)。(2)主动脉HE染色显示，与正常对照组相比，SHR模型组大鼠血管壁中层平滑肌层肥厚、平滑肌细胞有明显增生，细胞核密集深染，内皮细胞排列紊乱。补肾和脉方干预后血管壁各层的细胞状态得到了明显的恢复；下丘脑HE染色显示SHR模型组大鼠下丘脑的神经元细胞为圆形或不规则形，细胞核较大且呈圆形、不规则形或分叶状，着色较浅，周围组织有明显的水肿和炎性反应发生。补肾和脉方干预后下丘脑组织形态得到了明显的恢复，周围组织的水肿和炎性反应也得到了显著的改善。(3)与正常对照组比较，SHR模型组大鼠血清NPY、NE、CRP和AngⅡ含量均处于较高水平(P＜0.05)；与SHR模型组比较，补肾和脉方组SHR的血清NPY、NE、CRP和AngⅡ的水平有明显下降(P＜0.05)。
2.Labelfree高通量定量蛋白组学测序法联合GO富集分析、信息通路富集结果和蛋白互作网络分析，筛选出差异蛋白。与老年SHR模型相比，应用补肾和脉方干预后的大鼠的下丘脑中共检出2753个差异蛋白点，其中有314个蛋白有统计学差异，其中171个蛋白表达升高，143个蛋白表达降低；差异蛋白主要富集于转运酶活性和离子通道活性方面。主动脉中共检出1769个差异蛋白，发现285个蛋白有统计学差异，其中179个蛋白表达升高，106个蛋白表达降低。差异蛋白主要富集于泛醇-细胞色素-C还原酶活性、含核碱基的化合物激酶活性、糖结合、分子内转移酶活性，磷酸转移酶和异构酶活性方面。
3.差异蛋白验证结果显示，相较于SHR模型组，补肾和脉方干预8周后补肾和脉方组大鼠的主动脉中Rab5a和SFPQ的mRNA以及蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)，而Ckm和Hist2h3c2的mRNA水平以及蛋白表达水平则明显下降(P＜0.05)；在补肾和脉方组下丘脑中Cdc42和SIRT2在mRNA和蛋白水平上表达升高(P＜0.05)，而Ptk2b的mRNA和蛋白水平表达降低(P＜0.05)。
结论：补肾和脉方一方面可能通过降低AngⅡ含量，减少MAPK通路的Ptk2b激活，延缓细胞增殖；另一方面通过MAP通路，激活Rab5a过表达，促进细胞生长，改善血管重塑，最终起到控制血压的作用。