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肉毒神经毒素（BoNT）是自然界所发现的生物毒素（包括化学毒剂）中毒性最强的物质。由于BoNT毒性强并且极容易被恐怖分子利用，国际社会已将其列为重要的毒素战剂和最具威胁的生物恐怖剂之一。针对BoNT感染引起的肉毒中毒尚无较好的治疗手段，到目前为止也没有实用型的抗毒素问世，因而其疫苗的研究就显得更为重要。虽然类毒素、特别是其重链重组亚单位疫苗具有很好的保护作用，但均存在着不可忽视的潜在的副作用。多表位疫苗的提出为BoNT疫苗的研发提供了新思路，一方面多表位疫苗能够集中优势的中和表位，去除对保护性免疫不利的结构或潜在的毒性片段；另一方面能优化组合BoNT各种型别的中和性表位，为研制多价疫苗奠定基础，以解决目前国际上多以单一型别BoNT为主研究重组基因工程疫苗的弊端。因此开展BoNT多表位疫苗的探索性研究具有十分重要的医学和社会意义。首先，本研究基于保守性高的BoNT／A的氨基酸序列，根据BioSun和LaserGene软件包中的表位分析相关参数，辅以对BoNT／A蛋白的二级结构的分析，综合预测了BoNT／A的B细胞表位。结果表明，BoNT／A轻链的142-150、284-292区段，重链的440-450、465-480、538-549、699-710、751-760、1087-1095、1224-1231、1263-1270区段是B细胞优势表位区的可能性较大。然后，遴选预测得到的B细胞表位和文献报道的表位，并加入适当的辅助性元件：通用T细胞表位和Linker，设计了多表位串联体A、B。根据大肠杆菌密码子偏好性对其基因进行优化的基础上，经重叠PCR方法合成串联体A、B的基因全长。并构建了克隆测序质粒pMD18-T-A、pMD18-T-B进行序列分析鉴定，结果表明，重叠PCR合成的基因序列均与密码子优化后的基因序列完全一致。然后用BamHⅠ、HindⅢ分别双酶切pMD18-T-A、pMD18-T-B载体和表达载体pQE-30，并连接获得重组表达质粒pQE-30A，pQE-30B。经过双酶切和PCR鉴定正确后，转化到E．coli M15[pREP4]感受态细胞中，构建相应的表达工程菌。用IPTG进行诱导表达，发现这两种重组蛋白都以包涵体形式存在，表达量分别达到全菌蛋白的70％、54％。SDS-PAGE分析显示，与预期蛋白的大小相符，预期蛋白的分子量分别为22.4×103、24.9×103。Western印迹和间接ELISA结果显示重组蛋白串联体A、B均可被其特异性马血清抗毒素识别，进一步验证了串联体A、B基因在工程菌中获得正确表达，并具有良好的抗原性。Ni-NTA法纯化后分别获得纯度大于92.2％、99％的重组串联体A、B蛋白，然后采用透析复性法对其进行复性。接着，将串联体A、B分别与等体积的弗氏佐剂混合后免疫Balb／C小鼠，20μg／只，采用背部皮下多点注射的免疫途经。并以PBS作为对照。四免后血清效价达到103～104，说明设计表达的重组蛋白具有一定的免疫原性。四次免疫后一周，以2、5、10、20、40×LD50 BoNT／A腹腔攻击小鼠，观察小鼠存活天数。动物保护性试验发现，免疫组小鼠未表现出比对照组小鼠更好的抵抗天然毒素攻击的能力，并且ELISA及Western印迹试验表明，其免疫小鼠血清不能结合天然的BoNT／A。针对上述试验结果，在串联体A的基础上调整了设计方案，重新优化构建了三个串联体：串联体A′、C以及合成的表位串联体肽（串联体肽）。其中，串联体A′是用8M脲直接溶解串联体A重组蛋白的包涵体得到，即纯化后未经复性的串联体A；串联体C则是将串联体A的Th表位由C端移至N端。串联体肽是由文献报道的两个中和表位通过GGS相连构成。以串联体A′，C和串联体肽免疫Balb／C小鼠。攻毒试验表明新构建的三个串联体可以抵抗3×LD50天然BoNT／A的攻击。该保护作用还不及文献报道的单个表位合成肽免疫效果，据此推测串联体A、B无保护作用的主要原因可能是选用的LinkerGGS没有起到有效的分隔作用。同时认为Th的位置对表位设计影响不大。本研究虽然未能获得具有良好保护性的串联体，但发现了一些问题，做了一些有意义的尝试和探索，为今后BoNT多表位疫苗的进一步研究，提供了参考和借鉴。