龙眼（Dimocarpus longan Lour.）,无患子科龙眼属植物,是我国南方特有的亚热带果树植物。龙眼胚胎发育状况与种子大小、果实品质、座果率和产量密切相关。因此,龙眼胚胎学的研究对龙眼产业发展具有重要意义。然而,龙眼早期合子胚采集困难、遗传杂合度高、材料同步性差、发育过程不可控、易受环境影响等,阻碍了龙眼胚胎学的研究。龙眼体胚发生过程与合子胚胎发育过程相关的生理和形态变化相似,这为研究龙眼胚胎分子机制提供了理想模型。植物体胚发生是一个复杂的发育过程,涉及细胞分裂和细胞重编程,其基因的时空表达受激素、应激信号、遗传和表观遗传机制的调控。虽然已有证据表明DNA甲基化的变化与植物体胚发生密切相关。然而,基于全基因组单碱基分辨率检测体胚发生早期过程中的DNA甲基化动态变化研究还非常有限。并且circRNA作为表观遗传修饰中的重要调控因子,在植物体胚早期中的功能还尚不清楚。因此,为阐明DNA甲基化和circRNA在龙眼体胚早期中的作用机制。本研究利用DNA甲基抑制剂5-氮胞苷（5-AzaC）处理EC证实了DNA甲基化在龙眼体胚发生中的作用。采用全基因组亚硫酸氢盐测序技术（WGBS）生成了EC、ICp EC和GE阶段DNA甲基化的单碱基分辨率图谱。通过转录组测序分析了龙眼体胚早期过程中基因表达谱。鉴定了龙眼基因组中的DNA甲基化相关基因,并研究了这些基因在龙眼体胚早期过程中的表达模式。此外,对龙眼体胚早期中的circRNA进行了全基因组鉴定,分析了circRNA的表达模式,讨论了circRNA在龙眼体胚早期中的潜在作用机制。通过构建了DNA甲基化相关基因与circRNA、lncRNA及miRNA协同作用的ceRNA网络,揭示了circRNA在参与龙眼体胚早期DNA甲基化的潜在调控机制。主要研究结果如下:1.龙眼体胚早期DNA甲基化水平测定及5-AzaC对龙眼体胚形态建成影响采用DNA甲基化检测试剂盒对龙眼体胚早期EC、ICp EC和GE的整体甲基化水平进行测定,结果显示龙眼体胚早期整体甲基化水平在EC到ICp EC过程中呈下降趋势,在ICp EC到GE过程中微弱上升。利用5-AzaC处理EC,探究DNA去甲基化对龙眼胚性细胞增殖和发育以及对龙眼体胚胚性培养物整体甲基化水平的影响。结果表明2.5μM5-AzaC处理EC促进了细胞增殖和GE的形态建成。对2.5μM 5-AzaC处理9 d后的胚性培养物和对照组的整体DNA甲基化水平进行测定,结果表明5-AzaC处理后胚性培养物整体DNA甲基化水平降低。这些结果表明DNA去甲基化促进龙眼体胚发生。2.龙眼体胚早期全基因组DNA甲基化图谱分析利用WGBS和转录组测序技术对龙眼体胚早期EC、ICp EC和GE的DNA甲基化动态变化以及DNA甲基化水平与基因表达之间的相关性进行分析。结果表明,在整体水平上,EC、ICp EC和GE中5-m C水平分别为24.59、19.65和19.74%,表明EC到ICp EC阶段DNA甲基化程度呈下降趋势,ICp EC到GE阶段DNA甲基化程度略有上升。差异甲基化区域（DMR）分析表明,甲基化变化主要发生在CHH位点中。对CHH-DMR去甲基化相关基因进行GO和KEGG分析,发现这类基因主要富集在玉米醇溶蛋白生物合成、脂肪酸生物合成、昼夜节律和线粒体吞噬等通路。DNA甲基化与基因表达的相关性表明,龙眼体胚早期中DNA甲基化的降低并没有引起基因表达的广泛变化,基因表达可能受到基因及其下游区域甲基化变化的影响。3.龙眼DNA甲基化途径相关基因鉴定及表达分析基于龙眼基因组信息,对龙眼DNA甲基化途径相关基因进行鉴定与分析。结果表明,龙眼中存在93个DNA甲基化途径相关基因,包括33个从头甲基化途径相关基因,15个维持甲基化途径相关基因和45个主动去甲基化相关基因。对龙眼和拟南芥保守结构域和系统进化树分析显示,同源DNA甲基化途径相关基因具有相似的保守结构域,并且这些基因的系统发育树聚类紧密,表明不同植物中DNA甲基化途径相关基因的具有高度保守性。在龙眼DNA甲基化途径相关基因中鉴定到多个顺式作用元件,包括植物发育响应元件、胁迫响应元件和激素响应元件等。龙眼体胚早期中DNA甲基转移酶和去甲基化酶基因的表达模式表明,龙眼体胚早期中DNA甲基化降低的可能受DNA甲基转移酶基因和DNA去甲基化酶基因REPRESSOR OF SILENCING 1（ROS1）调控。龙眼DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶基因家族在不同激素（生长素2,4-D、赤霉素GA3、茉莉酸甲酯Me JA、水杨酸SA、乙烯ETH和脱落酸ABA）处理下的表达模式表明DNA甲基化在参与龙眼体胚早期激素响应方面发挥重要作用。4.龙眼体胚早期circRNA全基因组鉴定与特征分析采用高通量测序,对龙眼EC、ICp EC到GE中的circRNA进行系统性鉴定。在龙眼体胚早期三个阶段中共鉴定出5029个circRNA。GO和KEGG分析显示,差异表达circRNA的亲本基因在“非同源末端连接（NHEJ）”和“丁酸代谢”途径中显著富集。对龙眼体胚早期过程中活性氧（ROS）含量进行测定,结果表明,ROS诱导的DNA双链断裂可能不完全依赖于NHEJ修复途径。对相关代谢物（谷氨酸、γ-氨基丁酸和丙酮酸）的水平与参与丁酸代谢的circRNA及其亲本基因的表达水平进行相关性分析。结果表明,circRNA可能作为同源mRNA表达的调控因子,从而影响相关化合物的积累。通过构建龙眼体胚早期差异表达的circRNA、mRNA、lncRNA和miRNA组成的ceRNA网络。结果表明,这些ncRNA的假定靶标在KEGG通路“丝裂原活化蛋白激酶信号MAPK”和“氮代谢”中显著富集。对候选的circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA的表达模式分析证实了miRNA和ceRNA之间的负相关关系。此外,利用寡核苷酸化学合成方法,合成两个circRNA过表达载体瞬时转染龙眼原生质体,进一步验证了龙眼体胚早期中的ceRNA网络互作关系。5.调控DNA甲基化途径相关基因的非编码RNA鉴定及功能研究通过联合多组学数据分析龙眼体胚早期过程中ncRNA在DNA甲基化中的潜在作用。首先,对潜在的调控DNA甲基化途径相关基因的miRNA、lncRNA和circRNA进行了鉴定,并分析miRNA、lncRNA和circRNA与DNA甲基化调控基因之间的相关性。结果表明62个miRNA、10个lncRNA和53个circRNA可能参与DNA甲基化途径相关基因的调控。此外,过表达circ ROS1以探究其在影响亲本基因Dl ROS1中的作用,结果表明circ ROS1过表达促进了Dl ROS1的表达。通过构建DNA甲基化途径相关基因、circRNA、lncRNA与miRNA的ceRNA网络,并利用双荧光素酶实验验证circ CTPA2、Dl CMT3与mi R5813的靶向关系,结果表明circ CTPA2可能作为dlo-mi R5813的海绵,间接调控DNA甲基化酶Dl CMT3基因表达,从而参与龙眼体胚早期发生过程。综上所述,DNA甲基化抑制剂处理促进了龙眼体胚早期发生,表明DNA去甲基化对龙眼体胚发生至关重要。通过龙眼体胚早期DNA甲基化的单碱基分辨率图谱,揭示了DNA在龙眼体胚早期过程中的动态变化及调控机制。对龙眼体胚早期DNA甲基化途径相关基因表达模式分析发现,DNA去甲基化与DNA甲基转移酶基因表达的降低和DNA去甲基化酶基因ROS1表达的增加有关。本研究首次对龙眼体胚早期circRNA进行了全基因组鉴定,并对差异表达的circRNA在调控亲本基因及作为ceRNA的功能进行了分析,揭示了circRNA在龙眼体胚早期过程中可能发挥的生物学作用。此外,鉴定了龙眼体胚早期过程中潜在调控DNA甲基化途径相关基因的ncRNA,挖掘了潜在调控龙眼体胚早期DNA甲基化的circ ROS1和circ CTPA2。这些结果揭示了DNA甲基化和circRNA在龙眼体胚早期中的潜在作用,为植物体胚发生的复杂调控机制提供了新的见解。