四季蜜龙眼LFY基因启动子克隆及嫁接新梢转录组测序与分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 9次 | 上传用户:dengsanhua
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本研究以龙眼的两个品种(四季蜜和立冬本)为材料,对四季蜜成花变异分子机制进行初步探究。已有的研究表明,四季蜜易成花的特性与其叶芽中LFY表达量的增加有关,在此基础上,本研究从两方面入手进行进一步的研究,一方面,首先克隆四季龙眼LFY基因的启动子,和普通龙眼LFY启动子进行序列比较,研究四季蜜LFY的表达变异是否与启动子变异有关;另一方面通过嫁接新梢转录组测序,分析四季龙眼和普通龙眼嫁接新梢中差异表达的基因,以期找到与四季蜜成花特性发生变异相关的调控基因,了解龙眼成花的分子调控机制。主要研究结果如下:1四季蜜LFY同源基因启动子的克隆以四季蜜的幼叶为材料,提取基因组DNA,以已知的四季蜜龙眼LFY同源基因DNA序列设计特异性引物,用染色体步移方法,克隆得到了长度为1,227bp的四季蜜启动子序列。对启动子进行序列分析,结果表明:该启动子含有典型的TATA-box和CAAT-box,以及调控生理周期、响应光反应、MYB结合位点和赤霉素等反应元件。将四季蜜LFY启动子与立冬本启动子序列进行比对分析,共发现六处碱基差异,有一个碱基的差异在调控作用元件中。2转录组测序及生物信息学分析以四季蜜和立冬本的嫁接新梢为材料,用改良的TB法提取RNA,并用Illumina平台进行转录组测序,结果在四季蜜和立冬本中分别获得27,723,240个和25,603,968个clean reads,组装后,在四季蜜中共获得了平均长度为481bp的unigene40,982个,在立冬本中获得了平均长度为701bp的unigene36,527个;最后获得平均长度为703bp的All-unigene40,513个。对龙眼嫁接新梢转录组的All-unigene的cds进行blast分析,共获得了30,963个CDS片段;在ESTscan数据库中对转录组的cds进行分析,共获得了1,452个EST.scan片段;将All-unigene和COG数据库进行比对,共有10,646条可以与数据库中的基因具有相似性;共有24,855条All-unigene可以与GO数据库中的基因具有相似性,共有31,221个All-unigene可以与NR数据库中的基因具有相似性,有27,716条All-unigene可以和NT数据库中的基因具有相似性,有19,028条All-unigene与SwissProt数据库中的基因具有相似性。从测序数据看,测序结果较好。对转录组测序结果进行分析,筛选出了四季蜜和立冬本间与开花相关的538条显著差异表达的基因,其中下调表达基因数目是上调表达的2倍。538个基因在GO数据库中归类到42个GO terms,建立了2,365条对应关系;538个基因比对到KEGG数据库中,其中241个基因归类到69个途径中。对这些途径进行分析,发现了一些可能与四季蜜易成花相关的基因,包括一些酶催化基因、糖降解基因以及参与C/N比值调控的基因等。测序结果还发现,开花途径中三个抑制基因TFL1、FLC和SVP在四季蜜龙眼嫁接新梢中的表达有不同程度下降。3四季蜜和立冬本成花相关基因cDNA和基因组序列的克隆、比对和分析以四季蜜和立冬本幼叶、叶芽为材料,分别提取DNA和RNA,对开花相关途径涉及的关键基因(SVP、TFL和FLC)进行克隆。代号为SVP645的基因两个品种间氨基酸序列有一些差异性,而SVP2719两个品种间氨基酸序列没有差异;两个品种FLC基因氨基酸序列没有差异;TFL6027基因的cDNA和DNA序列在两个品种间都没有差异,而TFL6475的cDNA序列两个品种间没有差异,但DNA序列在第二个内含子序列存在一些差异。
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