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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA介导的序列特异的基因转录后沉默现象(post-transcriptional gene silencing,PTGS),目前已被广泛地应用到基因功能研究中。有研究表明,某些基因的沉默会影响动物的胚胎发育,甚至导致动物在胚胎早期死亡[1,2,3,4],从而阻碍了基因功能研究的进程。为了避免这一弊端,本研究拟建立以Cre/LoxP系统为条件触发开关的U6启动子驱动的条件性EGFP-RNAi体外模型。通过构建含Cre重组酶的载体和含有Loxp-中止信号-Loxp的靶基因RNAi表达载体(称为条件性RNAi载体),运用293T细胞模型对条件性RNAi载体功能进行体外实验研究,为条件性EGFP-RNAi转基因动物模型的制备奠定基础,从而为今后特定基因功能研究建立模型。本研究运用分子克隆技术,将LoxP-TS-CMV-RFP-LoxP片段引入普通的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pSilencer1.0-U6中,构建了可通用于各种靶基因的Cre触发的条件性RNAi转基因重组载体pU6-floxedRFP。另一方面,将cre编码序列插入到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP。建立Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pU6-floxedRFP)和Cre(+)组(pCMV-Cre-EGFP和pU6-floxedRFP),用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre酶的表达情况和重组效应。结果显示,转染后48h,Cre(-)组和Cre(+)组均可见绿色荧光和红色荧光表达,而Cre(+)组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪测定Cre(-)组和Cre(+)组的绿色荧光蛋白表达率分别为25.77%±2.53%和22.09%±5.45%,两者无显著差异(P>0.05);Cre(-)组和Cre(+)组细胞的红色荧光蛋白表达率分别为7.54%±2.85%和3.53%±1.62%,两者有高度显著性差异(p<0.01)。表明所构建的pCMV-Cre-EGFP具有表达活性并能重组pU6-floxedRFP。以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)为RNAi的靶基因,设计并合成shRNA片段及其阴性对照,插入到pU6-floxedRFP中,形成pU6-floxedRFP-shEGFP和pU6-floxedRFP-shEGFP-C。建立siRNA组(pCMV-Cre-EGFP和pU6-floxedRFP-shEGFP共转染)、siRNA(-)组(pCMV-Cre-EGFP和pU6-floxedRFP共转染)和siRNA(control)组(pCMV-Cre-EGFP和pU6-floxedRFP-shEGFP-C共转染),用FuGENE 6介导转染293T细胞,72h后流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,并应用荧光显微镜观察基因沉默效应。结果显示,转染后72h,荧光显微镜下可见各组均表达绿色荧光和红色荧光,但siRNA组的绿色荧光少于siRNA(-)组和siRNA(control)组。第一阶段siRNA组和siRNA(-)组的绿色荧光蛋白表达率分别为20.43%±1.37%和29.57%±4.54%,具有显著性差异(p<0.05)。第二阶段实验中,siRNA组、siRNA(-)组和siRNA(control)组细胞的绿色荧光蛋白表达率分别为15.37%±7.45%、27.88%±9.92%和22.7%±7.53%,siRNA组和siRNA(-)组具有高度显著性差异(p<0.01),siRNA组与siRNA(control)组具有显著性差异(p<0.05),siRNA(-)组和siRNA(control)组差别无统计学意义(p>0.05),表明pU6-floxedRFP-shEGFP具有受Cre触发并抑制EGFP表达的功能。综上所述,得出以下结论:本研究成功构建了Cre触发的条件性RNAi转基因载体pU6-floxedRFP、针对EGFP产生RNAi效应的pU6-floxedRFP-shEGFP及含报告基因的Cre酶表达载体pCMV-Cre-EGFP;噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒pCMV-Cre-EGFP能在体外表达具有活性的Cre重组酶;当Cre重组酶存在时,pU6-floxedRFP-shEGFP能对EGFP产生RNAi效应,基因沉默效率≥58.3%。结果证明了Cre/LoxP调控系统可以实现条件性的RNAi效应,从理论上证明了Cre触发的条件性RNAi转基因动物技术路线的正确性与可行性。