一碳代谢包括叶酸循环和蛋氨酸循环,参与多种生理过程包括嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成、维持氨基酸体内稳态、表观遗传学的维持、氧化还原平衡以及甲基化过程等等,其中一碳代谢中甲基化异常与与肿瘤的发生发展有着密不可分的联系。然而,目前有关甲基化的研究主要集中在基因和蛋白质水平,在代谢水平上甲基化与癌症亦有非常密切的关系。因此有必要对一碳循环中甲基化代谢进行深入研究,不仅有利于寻找与癌症相关的生物标志物,探索癌症在甲基化途径上可能发生的紊乱,更有可能为癌症的发病机理提供线索,为其诊疗和获取癌症新的治疗靶点提供可靠依据。但是甲基受体在体内种类繁多,甲基化代谢物的质谱分析特征性较低,相关代谢物的结构特异性不强且无特征官能团,因此难以建立统一的定性及定量分析方法对其实现有效检测,难以实现其整体定性识别和结构鉴定。本研究采用稳定同位素标记技术与同位素稀释定量分析方法,以乳腺癌细胞为研究对象通过代谢标记蛋氨酸的活性甲基(13CD3)对标记后的甲基代谢物进行追踪分析,开展了基于LC-MS技术的细胞内甲基化代谢物整体定性与相对定量分析方法研究,以实现对乳腺癌细胞与蛋氨酸相关的甲基化代谢特征分析;然后结合同位素稀释定量方法实现在不同分子分型的乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞的甲基化代谢谱的定量分析。本研究旨在建立甲基化代谢谱定性与定量分析新方法,该方法可能会为发现新的癌症发生发展生物标志物,阐明癌症发病机制等带来新的依据。本论文的研究内容主要包括以下三个部分:1.基于同位素代谢标记的甲基化代谢物定性分析方法研究本章第一节首先建立了细胞内代谢组和脂质组的非靶向LC-MS分析方法,为后续甲基化代谢物的寻找建立良好基础;第二节采用稳定同位素代谢标记技术,以乳腺癌细胞为研究对象开展蛋氨酸相关的甲基化代谢特征分析。研究首先考察并优化了细胞前处理方法并分别采用氨基色谱柱和C18色谱柱建立细胞内极性代谢和脂类代谢物的定性分析方法。然后将13CD3-蛋氨酸作为示踪剂引入到乳腺癌细胞的培养中,结合非靶向代谢组学研究策略寻找和鉴定标记的甲基化代谢物。研究最终寻找到与蛋氨酸代谢相关的20个甲基化代谢物,包括单甲基、二甲基、三甲基标记的代谢物,包括氨基酸类、寡肽类、磷脂酰胆碱类以及一些未经报道的新代谢物。由此,发现与蛋氨酸活性甲基相关的7条甲基化代谢途径,包括肌酸合成、组蛋白甲基化、磷脂酰胆碱的合成、精胺和亚精胺的合成、1-甲基烟酰胺的合成以及2条推测的代谢途径,并对关键性代谢物的甲基化通路进行了阐释。通过本章研究,建立了基于同位素代谢标记的细胞甲基化代谢物分析方法,发现了一些细胞中与蛋氨酸甲基化相关的代谢物和代谢途径,为阐明甲基化代谢机制提供了新的分析手段和依据。2.甲基化代谢物相对定量分析方法研究本研究建立了蛋氨酸相关的甲基化代谢物的LC-MS同位素稀释定量分析方法。研究首先通过分析不同标记时间的甲基化代谢物的同位素丰度比,发现细胞在标记培养48小时后代谢物基本达到标记稳态,并以此作为稳定同位素内标建立同位素稀释定量分析方法。然后,采用全扫描(Full MS)与单离子扫描(Single ion monitoring,SIM)相结合的质谱数据采集方式,对寻找到的甲基化代谢物建立了相对定量分析方法,并考察了该方法的线性及精密度。其中,所有代谢物工作曲线的线性拟合系数均达0.98以上,80%以上均大于0.99;绝大部分代谢物相对含量测定值的相对标准偏差(RSD)均小于20%,精密度良好。该方法能满足细胞样本中甲基化标记代谢物的相对定量分析要求。3.乳腺癌细胞甲基化代谢谱分析研究采用上述建立的LC-MS同位素稀释定量分析方法,对不同基因分型的乳腺癌细胞系和人乳腺上皮细胞系中的甲基化代谢物进行相对定量分析,寻找与乳腺癌相关的甲基化代谢物。结果表明,大多数的甲基化代谢物在乳腺癌中呈上调,其中二甲基精氨酸、蛋氨酸、和寡肽赖氨酸-甲基缬氨酸-甲基脯氨酸、甲基脯氨酸-甲基脯氨酸-赖氨酸-天冬氨酸上调2倍以上,三甲基赖氨酸和三甲基甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸上调超过5倍;而1-甲基烟酰胺在乳腺癌细胞中显著下降,下调倍数超过5倍。值得注意的是,1-甲基烟酰胺在乳腺癌细胞中显著下调可能是和代谢通路上下游的相关代谢酶有关但目前尚未得到确证,还需更深入的验证实验。且不同基因分型的乳腺癌细胞间甲基化代谢谱差异较大,可能和相关的基因表达有关,后期将进行深入的生物学验证。