双光子激光扫描显微技术凭借细胞或亚细胞水平的高分辨率,目前已经被广泛地应用于观察活体哺乳动物的神经元的神经活动。然而随着神经科学研究的不断深入发展,双光子激光扫描技术的局限也开始显现出来,其中最主要的局限就是观察区域仅仅局限于单一较小视场内(<1mm直径)。这是由于以往的神经科学研究往往都专注以单一脑区的研究,然而在哺乳动物的大脑皮层上分布着负责各种不同功能的脑区,此外除皮层外,还有很多位于大脑内部的对生物活动起到极其重要作用的脑区如海马,纹状体等。由于生物活动是一系列复杂的神经活动的共同作用,涉及很多不同脑区的相互协同和作用,于是,能够同时观察多个脑区的神经元活动对了解大脑的神经元作用机制就变得尤为重要。这里我们提出一种新颖的成像技术,该技术允许对在最大为12mm直径的范围内对不同脑区进行同时的钙信号活动记录,每个脑区的单个视场在200μm直径左右,并实现单细胞分辨率的成像质量以及最低10Hz的快速成像速度。同时我们还进一步扩展了该系统的成像范围从原有的平面到三维立体空间。为了进一步展示该技术的可行性,我们研究了一套合理的生物成像实验的相关技术以配合该技术的实施。例如我们展示了对于小鼠在麻醉和清醒不同生理状态下的初级视觉皮层,初级运动皮层以及海马CA1区的神经元活动的同时记录。该技术的特点在于通过设计优化后的自聚焦透镜和低倍空气物镜的配合,可使得在2维平面上的视场扩展提升为在3维空间上的视场扩展。换句话说,该技术可在横向和纵向上对不同区域实现实时成像,以上述例子为例,虽然海马区与皮层脑区在纵向上的距离已经大于1mm,但是应用该技术可以良好地实现同时观测的目的。本文的主要研究内容如下:1.研究搭建了基于两种不用快速扫描方案的快速双光子激光扫描显微镜,并最终将两套快扫系统整合到一台双光子显微镜上。一套系统为基于检流计式振镜和共振式振镜为扫描器的快扫系统,主要包括X扫描振镜(共振式振镜)、Y扫描振镜(检流计振镜)和扫描透镜和镜筒透镜。光束传播过程为:激光从飞秒光源模块发出,到达X/Y扫描振镜位置,被X/Y扫描振镜扫描后进入扫描透镜并聚焦在扫描透镜工作平面,随后经镜筒透镜的准直进入荧光显微物镜并激发荧光物质。最快速度为1000Hz(像素尺寸600×24),最大扫描为分辨率为4096×4096像素(帧率为6Hz)。另一套为基于双轴声光偏转器的快扫系统,经过对声光晶体色散补偿设计以及提出利用四个换能器提高声光品质系数和衍射效率,该系统最大帧率为10000Hz(像素尺寸250×40),由于上述系统具有超高的扫描速度相较于振镜扫描系统有着更高的信噪比,最大提高了175%,同时在相同信号水平下,我们研究发现10000Hz速率较低的扫描速率有着更定的荧光光漂白,这可以实现更长时间的神经活动观察。基于以上两种快扫系统的研究,振镜系统尽管扫描速度不如后者,但配合低倍空气物镜可以提供更大的视野范围,所以我们选择使用以检流计式振镜和共振镜的配合为扫描系统作为多脑区双光子显微的扫描器。实验验证表明,可满足多种的生物实验要求。2.研究搭建了快速多脑区双光子激光扫描显微系统,该系统首次采用多根自聚焦透镜与低倍空气物镜结合,首次实现对皮层正上方的三个脑区第二层神经元活动的同时记录。并最终可对空间立体分布的不同脑区进行同时观察。通过不同的空气物镜与自聚焦物镜结合,我们细致分析了不同组合的主要光学参数-分辨率,同时对NA匹配与不匹配下的能量耦合情况进行了仿真。同时为了实现对能量利用的最大化,我们还设计了NA匹配的自聚焦透镜,并从实验与计算上比较了二者的差别。此外除了进一步实现对不同脑区神经元活动的同时观察,我们设计了另一款自聚焦透镜,通过不同自聚焦透镜与低倍空气物镜的配合,实现首次对横向与纵向不同分布位置的三个脑区钙信号记录。3.研究设计了多脑区生物成像实验方法以及相关实验器件的设计。由于该技术的独创性,使得以该系统为主的生物神经成像实验需要有相对应的实验方法,尤其是配合光学系统的小鼠固定装置,以及手术方法。因为不同于传统的开颅手术,为了实现对多个脑区的同时成像,需要在小鼠颅骨上固定特定的固定皿(chamber),并根据所需要成像的脑区位点,在chamber上提前设计出相应位点,并根据此进行,多个位点的开颅手术。此过程较传统实验更为复杂,为了更好地通过该系统实施实验,我们摸索了相关的手术实验技术和过程,设计制定了相对应的手术实验步骤,确保了实验的成功率与实验质量。该技术结构简单,只需在传统的双光子显微镜上简单地改造,便可成为多脑区的双光子显微镜,这将极大地帮助了神经科学领域的研究人员对于活体哺乳动物的不同脑区的神经元活动的观察和研究,为推动相关研究提供有力的技术手段。