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目的:通过上调小鼠心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)中Tbx3的表达水平,研究Tbx3在小鼠CSCs向起搏样细胞分化过程中的作用。方法:1、小鼠CSCs的分离、培养及传代:取昆明小鼠心脏组织,通过心肌组织块贴壁培养法获取原代小鼠CSCs,待CSCs长满约70%培养皿底时,传代并继续培养。2、Tbx3过表达载体的构建:以购买的质粒DNA为模板,PCR扩增Tbx3,重组到质粒载体后完成基因测序,与目的基因序列对比;3、Tbx3过表达慢病毒包装及滴度测定:用构建好的Tbx3过表达载体转染293T细胞,分两次收集病毒并纯化,RT-PCR检测病毒滴度;4、连续观察感染Tbx3过表达慢病毒后CSCs生长情况及形态学变化;5、感染后第3天,RT-PCR检测HCN2、HCN4在mRNA水平的表达,第7天,Western-blot检测HCN4和HCN2蛋白水平的表达。结果:1、组织块培养法培养原代小鼠CSCs:组织块接种4h后开始贴壁,5～7d左右开始在心肌组织块周围长出小、圆、亮的细胞,生长于成纤维细胞上层,胞浆折光性好,高倍镜下未见核仁,14d左右可长满约70%培养皿底,无明显核仁;2、成功构建Tbx3过表达慢病毒,测得病毒滴度为2.09×108 TU/ml;3、Tbx3过表达慢病毒在小鼠CSCs中表达:预实验显示感染复数(multiplicity of infection,MOI)是70的Tbx3过表达慢病毒感染小鼠CSCs72h后,Western-blot实验检测到84KD大小的Tbx3蛋白表达,而空白对照组和阴性对照组小鼠CSCs无Tbx3表达,说明Tbx3过表达慢病毒成功感染小鼠CSCs,并获得高水平表达;4、小鼠CSCs感染Tbx3过表达慢病毒3d后,HCN4 mRNA表达水平较空白对照组上调约20倍(P<0.05),较阴性对照组上调约5倍(P<0.05);HCN2的mRNA表达水平与对照组相比无显著差异(P>0.05);5、Western-blot检测结果:感染3天,Tbx3过表达慢病毒的小鼠CSCs及对照组小鼠CSCs在Western blot实验中均未检测到HCN2、HCN4表达。结论:1、组织块贴壁培养法获得小鼠CSCs是稳定、可靠的;2、Tbx3过表达慢病毒感染CSCs的最佳感染复数为70;3、Tbx3在转录水平上调HCN4表达,但不上调HCN2表达;4、单纯上调Tbx3表达未能使CSCs分化为起搏样细胞。