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研究目的:低血糖是糖尿病治疗过程中最常见的并发症之一,严重威胁糖尿病患者的生命健康与生活质量。国内外均有文献提示低血糖事件与糖尿病患者认知功能障碍的发生密切相关。兴奋性氨基酸毒性是低血糖脑损伤进而导致认知功能障碍的病理机制之一,而神经元-星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺代谢偶联对维持脑中谷氨酸平衡及保护神经元功能起重要作用。基于此,本研究观察了低血糖对神经元-星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺代谢偶联的影响,探讨低血糖神经元损伤机制,以及兴奋性氨基酸毒性介导NMDA受体-ERK-CREB信号通路变化在低血糖相关认知功能障碍中的作用,从而为低血糖引发的认知功能障碍的机制研究提供理论依据。研究方法:1)体外建立小鼠海马神经元和星形胶质细胞共培养体系模拟大脑细胞微环境,给予无糖培养基构建神经细胞低血糖模型,利用MTT法检测无糖处理2h、4h、6h后神经元存活率,寻找低血糖建模的最佳方法;2)利用HE染色观察低血糖对神经元形态学的影响;应用Hoechst/PI荧光染色的方法检测低血糖对神经元凋亡的影响;3)检测低血糖对神经元、星形胶质细胞、培养基中兴奋性氨基酸谷氨酸浓度的影响;检测低血糖对星形胶质细胞谷氨酰胺合成酶活性及神经元内谷氨酰胺酶活性的影响;利用western blot的方法检测低血糖对星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT2的变化,从而明确低血糖对谷氨酸-谷氨酰胺循环的影响;4)利用western blot的方法检测低血糖对神经元学习记忆相关信号通路蛋白NMDA、pERK/ERK、pCREB/CREB、及其下游突触可塑性蛋白BDNF、synapsin1和Arc表达情况。研究结果:1)MTT结果显示,无糖培养基处理神经细胞共培养体系6h为神经细胞低血糖模型最佳建模时间。2)HE染色结果显示,给予低血糖处理后神经元形态学发生明显改变。Hoechst/PI荧光染色结果提示,低血糖可显著增加神经元凋亡。3)低血糖可显著增加神经元、星形胶质细胞和培养基中兴奋性氨基酸谷氨酸含量,神经元中谷氨酰胺酶活力增强、星形胶质细胞中谷氨酰胺合成酶活性增强,EAAT2蛋白表达增多。4)低血糖引起神经元与学习记忆关系密切的NMDA受体-ERK-CREB信号通路相关蛋白NMDA、pERK/ERK、pCREB/CREB及下游突触可塑性蛋白BDNF、synapsin1和Arc表达降低。研究结论:给予神经元-星形胶质细胞共培养体系更换无糖培养基处理6h建立中枢低血糖模型,并得出以下结论。1)低血糖可以影响神经元形态及突触可塑性,加速神经元凋亡。2)低血糖可以引起神经元-星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺循环功能紊乱。一方面,低血糖时星形胶质细胞加强对谷氨酸的摄取能力,减轻神经元所受的兴奋性毒性损伤,但星形胶质细胞的该作用有限,并不能抵消神经元所受的谷氨酸介导的兴奋性氨基酸毒性损伤;另一方面,兴奋性氨基酸毒性参与低血糖神经元损伤并影响学习记忆相关信号通路及突出可塑性蛋白的表达,从而造成学习记忆能力下降、认知功能减退。