HIV-1整合酶介导的病毒.DNA整合进宿主DNA的过程是HIV在宿主细胞中增殖的关键步骤。由于在正常人类细胞中不存在相似的功能蛋白,整合酶抑制剂对人体的副作用可能较小。与经典AIDS治疗药物的众多毒副作用相比,整合酶抑制剂理论上具有优势,因此成为艾滋病研究的新靶点。但由于HIV整合酶仅核心部分立体结构得到阐明,不利于进行计算机辅助设计,而32p同位素标记的检测方法又不适于大量筛选。为促进HIV整合酶抑制剂的开发,本文构建了两种以HIV整合酶为靶点的抗HIV药物筛选模型,分别为改良ELISA体外药物筛选模型以及酿酒酵母致死药物筛选模型。　　 改良ELISA体外药物筛选模型的原理为用合成的类似于病毒U5 LTR3’端的30bp的寡核苷酸为供体底物,生物素标记的20bp的人工合成的寡核苷酸作为靶底物,在体外反应体系中,重组的整合酶可以发挥酶3’切割和链转移活性而将靶底物与供体底物整合,利用亲和素标记的碱性磷酸酶显色系统可以对整合酶活性进行定量(酶标仪测A405)。根据这一原理,本文首先通过分子生物学手段构建高效表达HIV整合酶的pET28a-His-IN,并将其成功转化E.coli BL21(DE3)。为了使蛋白能够高效表达,对其表达条件进行了优化并通过Ni-NTA柱分离纯化而得到纯度较高的整合酶,实验结果表明HIV-1整合酶在诱导剂IPTG浓度为0.4mM、诱导时间为4个小时、诱导温度为37℃时获得最大量的表达,在此基础上建立了改良ELISA快速检测方法并对此方法合理性进行了评估,首先进行重复性实验,同批实验中重复3次,平均P/N值(加整合酶蛋白的阳性对照组A405/不加整合酶蛋白的阴性对照组A405)为2.40±0.126,批内变异系数为4.63％；不同的3批重复实验,平均P/N值为2.454±0.174,批间变异系数为5.89％。说明此方法重现性以及稳定性好。另外利用化学院合成的抗整合酶标准品-邻苯甲酰胺二聚体、默克公司生产上市的抗整合酶药物-Raltegravir以及蛋白酶抑制剂-PepstatinA,对此模型的特异性进行了评估,结果显示邻苯甲酰胺二聚体的IC50为187.3uM±14.3uM、Raltegravi的IC50为823.6uM±30.5uM,而Pepstatin A则未显示出抑制作用,表明此模型具有特异性。　　 酿酒酵母致死药物筛选模型的原理为整合酶在酵母细胞内的高效表达对酿酒酵母基因组.DNA起到一定的破坏作用而导致酿酒酵母的死亡。根据这一原理,本研究通过分子生物学手段构建两个质粒pYES2.0-IN以及pYES2.0,并成功转化酿酒酵母BJ2407。通过测定二者的生长曲线,发现表达整合酶的酿酒酵母生长率为不表达整合酶的酿酒酵母生长率的79％。在此基础上构建了酵母致死药物筛选模型并对此模型的合理性进行评估,首先进行了重复性实验,同批实验中重复3次,两者存活率比值为79.30％±0.026,批内变异系数为7.45％；不同的3批重复实验,两者存活率比值为79.9％±0.174,批间变异系数为9.69％。结果表明此方法重现性以及稳定性好。另外利用化学院合成的抗整合酶标准品-邻苯甲酰胺二聚体、默克公司生产上市的抗整合酶药物-Raltegravir以及蛋白酶抑制剂-Pepstatin A对此模型特异性进行了评估。结果为:邻苯甲酰胺二聚体的IC50为270.3uM±30.5uM、Raltegravi的IC50为1156.6uM±14.3uM,而Pepstatin.A则未表现出抑制作用,这表明此模型特异性强。　　 该项研究分别从体内以及体外两个不同的角度设计出两种以HIV-1整合酶为靶点的抗HIV药物筛选模型,两个模型的构建为多效抗HIV药物的开发奠定了理论基础,并且具有很好的应用前景。