论文部分内容阅读
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)是我国传统的名贵中药,多糖是三七的主要活性成分之一。热水提取的三七总多糖已经有研究报道,主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫及神经保护等多种功效。由于受到植物细胞壁中淀粉粒的干扰,热水提取并不能获得三七中全部的多糖。为了充分利用三七资源,更好地研究其活性成分,本论文先用热水提取,再用α-淀粉酶溶液提取,制备出水提和α-淀粉酶提的三七多糖。对得到的两种总多糖分别进行系统分级,纯化出每种多糖的均一级分,并利用化学法、生物法及仪器法详细地分析均一级分的结构。同时,以秀丽线虫为模型对三七多糖的抗衰老活性进行研究。研究结果如下:一、水提三七多糖的分离纯化及结构分析水提制备的三七总多糖(PNP)得率为4.7%,单糖组成为Glc(62.1%)、Gal(17.5%)、Gal A(9.9%)、Ara(6.1%)和Rha(2.5%)。利用离子交换层析和凝胶层析对PNP进行分离纯化,得到1种中性多糖级分(PNPN)和6种分子量均一的酸性多糖级分(PNPA-1A、PNPA-2A、PNPA-3A、PNPA-1B、PNPA-2B和PNPA-3B)。利用酶解法、甲基化、红外光谱和核磁共振等方法对均一级分进行结构分析,结果表明:1.中性多糖PNPN为淀粉样葡聚糖,Glc含量占80%以上,分子量为191 k Da,分支度为6%左右;2.酸性级分PNPA-1A和PNPA-2A为阿拉伯半乳聚糖(AG)型果胶,Ara和Gal含量之和都高于80%,它们的分子量分别为88 k Da和101 k Da,其结构中糖残基的主要连接方式为β-D-1,4-Galp、α-L-1,5-Araf和α-L-1,3,5-Araf。酸性多糖级分PNPA-3A中Rha与Gal A的比值接近1,二者含量之和高于25%,属于I型聚鼠李半乳糖醛酸型(RG-I)果胶。它们的主链是由二糖[-2-α-L-Rhap-1→4-α-D-Galp A-1-]重复单位组成,Rhap的O-4位形成侧链,分支度约为67%,侧链为线性或分支的(1→5)-α-L-arabinan、(1→4)-β-D-galactan、I型阿拉伯半乳聚糖(AG-I)和II型阿拉伯半乳聚糖(AG-II)。酸性多糖级分PNPA-1B、PNPA-2B和PNPA-3B为同聚半乳糖醛酸型(HG)果胶,分子量分别为3 k Da、6 k Da和18 k Da,甲酯化度均在12%以下,表明三七水提多糖中主要含有低酯化HG型果胶。二、α-淀粉酶提三七多糖的分离纯化及结构分析α-淀粉酶溶液接续提取的三七总多糖(PNPE)得率为6.5%,高于水提多糖PNP的得率,表明热水提取后的三七中仍存在大量的多糖。PNPE的单糖组成为Glc(76.1%)、Gal(10.2%)、Gal A(6.0%)、Ara(6.0%)和Rha(1.3%)。利用离子交换层析和凝胶层析对PNPE进行分离纯化,得到1种中性糖级分(PNPEN)和6种均一的酸性多糖级分(PNPEA-1A、PNPEA-2A、PNPEA-3A、PNPEA-1B、PNPEA-2B和PNPEA-3B)。综合运用酶解法、甲基化、红外光谱和核磁共振等方法对均一级分进行结构分析,结果表明:1.中性多糖PNPEN主要为低分子量葡聚糖,Glc含量高于80%,分子量为2 k Da,推测由高分子淀粉样葡聚糖经α-淀粉酶降解后产生。2.酸性多糖PNPEA-1A和PNPEA-2A为AG型果胶,分子量高于水提制备的AG型果胶,分别为170 k Da和140 k Da。两者中Ara和Gal含量高于80%,其结构中糖残基的主要连接方式为β-D-1,4-Galp、α-L-1,5-Araf和α-L-1,3,5-Araf。酸性多糖PNPEA-3A和PNPEA-1B中Rha与Gal A的比值接近1,含量之和均在25%,属于RG-I型果胶。它们的主链由二糖[-2-α-L-Rhap-1→4-α-D-Galp A-1-]重复单位组成,Rhap的O-4位形成侧链,分支度较低于水提制备的RG-I型果胶,分别为43%和26%。两者的侧链以(1→5)-α-L-arabinan,(1→4)-β-D-galactan或AG-I为主,含有少量的AG-II。酸性多糖PNPEA-2B和PNPEA-3B为HG型果胶,分子量略高于水提制备的HG型果胶,分别为14 k Da和42 k Da。与水提制备的HG型果胶相似,酶提制备的HG型果胶甲酯化度均在12%以下,同样为低酯化HG型果胶。三、三七多糖的抗衰老活性研究本文基于秀丽线虫模型对三七多糖的抗衰老活性进行研究,结果表明,水提总糖PNP和酶提总糖PNPE分别使野生型秀丽线虫的平均寿命延长7.8%(P=0.0002)和16.0%(P<0.0001),PNPE的活性更为显著。进一步分析了离子交换分级得到的中性多糖(PNPN、PNPEN)和酸性多糖(PNPA和PNPEA)的抗衰老活性。PNPN处理组结果与对照组相比无显著差异(P=0.2357),而PNPEN可以显著延长野生型秀丽线虫的寿命(6.7%,P<0.0001)。PNPEN和PNPN均为类淀粉葡聚糖,PNPEN(2 k Da)的分子量显著低于PNPN(191 k Da),推测低分子量的葡聚糖具有较好的抗衰老活性。PNPA和PNPEA对线虫寿命的影响相似,分别可使野生型秀丽线虫的平均寿命延长13.7%和15.6%(P<0.0001)。对酸性糖主要均一组分(PNPA-2A,PNPA-2B,PNPEA-1A,PNPEA-2B)的抗衰老活性进行分析,发现它们均能使野生型秀丽线虫的寿命延长15%左右,进一步表明AG型果胶和HG型果胶是三七多糖中发挥抗衰老作用的主要活性成分。综上,本文利用热水煮提和α-淀粉酶溶液提取两种手段分别制备了两种三七中的总多糖,使多糖产率提高一倍。同时,本文对两种方法制备的总多糖进行了系统分级和结构分析,分析比较了两种提取方式制备出多糖的结构特征。此外,本文对主要多糖级分的抗衰老活性进行分析,明确了三七多糖中发挥抗衰老活性的主要结构单元。以上研究结果丰富了三七多糖的结构信息,为三七多糖构效关系研究奠定了基础,为充分开发和利用三七多糖资源提供了理论和指导。