论文部分内容阅读
低聚半乳糖（galactooligosaccharides,GOS）是由2-8个半乳糖基组成的一种功能性低聚糖,具有多种生物活性。已有研究表明,GOS能够降低炎症因子分泌、缓解炎症,但其抗炎作用机理尚不明确。本文通过构建体外炎症模型,探究GOS聚合度与其抗炎活性的联系;在抗炎活性的指导下,合成抗炎活性更强的GOS;对合成的GOS进行分离纯化、结构表征,并验证其体外抗炎活性;构建结肠炎小鼠模型,阐释GOS的抗炎活性及其作用机制,为GOS的功能性应用及功能食品的研发提供理论依据。主要研究结果如下:（1）GOS体外抗炎活性及其构效关系探究。以不同聚合度的GOS为研究对象,通过LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症模型,考察GOS的体外抗炎活性并探究其抗炎活性与聚合度的内在联系。结果表明,与模型组相比,GOS能显著降低炎症介质一氧化氮（nitric oxide,NO）、白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（interleukin-6,IL-6）等促炎因子的分泌,表明GOS具有较好的抗炎活性。不同聚合度的GOS在调控促炎症细胞因子与炎症介质分泌能力上差异显著,表明GOS体外抗炎活性与其聚合度密切相关,即在一定的聚合度范围内,聚合度越高,其抗炎活性越好。尤其是低聚半乳四糖（galactotetraose,tetra-GOS）表现出最强的抗炎活性。（2）酶法合成GOS工艺优化。以乳糖为原料,研究β-半乳糖苷酶的不同来源及酶催化反应的不同条件对GOS总产率及tetra-GOS产率的影响,通过Box-Behnken试验设计及响应面分析法对β-半乳糖苷酶法合成GOS工艺进行优化。结果表明,酶法合成GOS的最佳工艺:使用米曲霉来源的β-半乳糖苷酶,起始乳糖浓度300g/L、加酶量8.25 U/g、反应温度49℃、反应时间16 h、反应p H 5.6。在此条件下,GOS产率达到14.61%±0.19%,tetra-GOS产率为3.31%±0.15%。（3）GOS纯化鉴定及抗炎活性验证。通过葡聚糖凝胶G-15柱层析、高效液相色谱、液相色谱质谱连用、核磁共振等方法对酶法合成GOS产物进行分离纯化、结构表征,并在体外炎症模型下,探究不同聚合度GOS产物的活性差异。结果表明,纯化得到3种GOS,分别为Galβ（1→6）Galβ（1→4）Galβ（1→4）Galβ（1→4）Glc、Galβ（1→6）Galβ（1→4）Galβ（1→4）Glc、Galβ（1→6）Galβ（1→4）Glc。这三种GOS均具有较强的抗炎活性,且低聚半乳五糖＞低聚半乳四糖＞低聚半乳三糖,三者之间抗炎活性差异显著（P＜0.05）,与前述结果一致。（4）GOS体内抗炎活性评价与作用机制探讨。以制备得到的GOS为研究材料,评价其对葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium,DSS）诱导结肠炎模型小鼠的抗炎活性并探讨其作用机制。结果表明,GOS能够有效缓解结肠炎小鼠体重下降、腹泻及便血等症状,从而降低疾病活动指数评分;抑制结肠缩短,有效逆转脾脏指数升高。GOS通过维持结肠组织完整、减少炎症浸润、抑制上皮细胞凋亡、上调闭合蛋白（occlusal protein,occludin）和闭锁小带蛋白1（zonula occludens,ZO-1）的表达以促进肠屏障功能等方面对DSS诱导的结肠炎起到保护作用。同时,GOS能够激活Nrf2/Keap-1抗氧化信号通路、抑制NF-κB炎症通路的激活和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）1/2的表达,通过上调抗炎因子白介素-10（interleukin-10,IL-10）的表达、抑制髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性以及降低结肠促炎因子和促炎酶的表达,进而降低炎症介质NO和前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的产生来减轻结肠炎症。并且,GOS还能通过恢复肠道微生物群多样性来减轻结肠炎。通过本论文的研究,我们初步探明了GOS的体外抗炎活性及其构效关系,优化了高活性GOS的酶法合成工艺,揭示了GOS抗炎活性的潜在作用机制。研究结果可为GOS的功能性应用及功能食品的研发提供理论依据,为GOS在结肠炎防治方面的应用提供参考。