鳗弧菌是海洋鱼类弧菌病(一种高致死性的出血性败血症)主要病原体之一。本研究通过分子克隆、基因重组技术,在体外将鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力的主要决定因素、同时也是铁离子转运载体系统中的主要成分——外膜蛋白FatA(OM2蛋白)的编码基因fatA连接到pET-28a(+)表达载体上,而后转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达外源蛋白FatA(OM2蛋白),进而利用表达的外源蛋白制备抗原,免疫动物,最终得到抗血清,为进一步研制鳗弧菌的活载体疫苗奠定了基础。本实验首先以鳗弧菌菌株MVM425为材料,利用SDS裂解法对pEIB1质粒进行提取,并以提取的质粒为模版,利用PCR扩增得到蛋白FatA的编码基因fatA,经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后将其连接入pET-28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,并对重组子进行双酶切鉴定以及序列测定。重组质粒经双酶切,得到两条片段,片段大小分别对应pET-28a(+)质粒以及PCR扩增产物。将重组质粒进一步进行测序,结果显示的碱基序列与文献中已报道的碱基序列完全一致。编码的蛋白质为融合蛋白,在该蛋白的C末端引入了6个组氨酸(His标签),利于后续蛋白纯化。将阳性重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),用1mM的IPTG诱导目的蛋白表达,并对蛋白在菌体内的表达形式进行分析。SDS-PAGE结果显示,与对照菌相比,经IPTG诱导后的重组菌在分子量为86KDa处有蛋白表达,该蛋白的大小与文献中已报道的FatA蛋白的大小一致。进一步分析表明,在37℃条件下经1mMIPTG诱导3h时蛋白表达量最大,并且表达的蛋白大部分是以包涵体的形式存在的。用2M尿素对包涵体蛋白进行初步洗涤后,利用目的蛋白的多聚组氨酸尾巴进行亲和层析以纯化目的蛋白。将纯化得到的目的蛋白经PBS透析、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒定量后,用30%的PEG8000浓缩至适当浓度,制备抗原免疫动物,以收获抗血清,并利用得到的抗血清进行琼脂双向扩散以及蛋白质印迹。经琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1:128;蛋白质印迹的结果显示,在硝酸纤维素膜上特异性的显示出了分子量为86KDa的蛋白条带。综上所述,重组质粒pET-28a(+)/fatA能够成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出外源蛋白FatA,所获得的融合蛋白的大小与预期相同。利用亲和层析纯化