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2004年,Shen G等在Synechococcus PCC7002中发现裂合酶编码基因cpcS、cpcT、cpcU和cpcV,这些基因所编码的蛋白质能催化藻胆色素和藻胆蛋白脱辅基的结合。通过同源分析软件发现基因sll0853与cpcS具有较高的同源性,本文针对基因sll0853是否具有裂合酶的功能进行研究,主要研究内容包括: 1)提取PCC6803的DNA,基因sll0853PCR扩增,获得目的基因,构建克隆载体T-0853和表达载体pET-0853,利用生物信息学软件分析基因sll0853的蛋白结构,并通过软件预测目的蛋白分子大小,SDS-PAGE蛋白电泳进行鉴定,对sll0853基因表达蛋白在不同诱导时间、温度和IPTG浓度条件下优化。 2)将两个基因 sll0853与 cpcB共同连接至一个共表达载体 pACYCDuet-1中,因为载体pACYCDuet-1有两个多克隆位点区域,每个多克隆区域都有一个T7启动子,可以连接两个目的基因,共同表达,构建重组载体pACYC-cpcB-0853。pET-ho1-pcyA表达 PCB,为本实验室保存。为了使重组体系的共表达产物达到最大值,分别对两个重组载体蛋白表达条件进行优化。 3)将pACYC-cpcB-0853和pET-ho1-pcyA共转化至大肠杆菌感受态中,对重组体系pACYC-cpcB-0853+pET-ho1-pcyA的共表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和紫外荧光光谱测定,验证基因sll0853是否具有裂合酶的功能。 4)为了确定sll0853基因的功能,构建缺失基因sll0853的突变株。将sll0853基因片段敲除替换成卡那霉素抗性基因片段,将构建好的含卡那抗性重组质粒自然转化转入集胞藻 PCC6803中,利用卡那霉素抗性筛选,得出同源重组成功的阳性转化子,突变藻种培养,对突变株与野生株在BG11培养基和不同光照强度下的OD值,绘制曲线,进行比较。 从NCBI上找到基因sll0853,此基因为未知功能基因,首先对基因进行克隆和表达载体的构建,在对目的基因的蛋白结构进行分析和对其功能进行预测,分析发现该基因编码的蛋白可能具有色素裂合酶作用或者与裂合酶相似的功能。利用分析的蛋白结构对Sll0853蛋白表达,表达的条件进行优化,得出最佳的诱导表达条件,结果表明在28℃、0.2 mM IPTG、诱导6 h蛋白表达量最大,为蛋白纯化提供了条件;其次构建重组体系研究基因sll0853的裂合酶功能,为了使重组体系的蛋白表达量最大,所以对两个重组载体进行了蛋白优化,这是本文的创新点,结果表明:22℃、0.2 mM IPTG、诱导5 h重组质粒pACYC-cpcB-0853的蛋白表达量最大;22℃、0.6 mM IPTG重组质粒pET-hol-pcyA的蛋白表达量最大,电泳还表明pET-hol-pcyA在不同时间的蛋白表达量差别不大。但是对重组体系的表达产物进行 SDS-PAGE蛋白电泳和紫外荧光光谱测定,蛋白电泳图谱在相应的位置并无条带出现,荧光光谱在620 nm处也无显示,初步断定表明基因sll0853不具有裂合酶的功能。最后,为了进一步确定基因sll0853的功能,构建缺失基因sll0853的突变株,进一步通过突变株与野生型藻的比较,研究基因sll0853的功能。