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背景与目的宫颈癌的发病率和死亡率在女性所有癌症中位列第四。近年来,虽然宫颈癌新的治疗方法不断涌现,但是晚期和复发性患者的治疗效果仍然很差,因此新型高效的治疗方法和药物有待开发。土荆皮乙酸(Pseudolaric acid B,PAB)是从土荆皮中分离出来的具有生物活性的二萜类化合物,已被证明具有一定的抗癌作用,但对宫颈癌的治疗作用及其分子机制尚不明确。配对盒基因2(Paired Box2,PAX2)是PAX转录因子家族成员之一,研究显示PAX2在多种肿瘤组织中被重新激活并表现出促进癌细胞增殖、存活和迁移的特性,并有可能介导PAB的抗肿瘤作用。本研究拟证实PAB对宫颈癌细胞的体外抗肿瘤作用,并探索PAB和PAX2的调控关系,进而揭示PAB抗肿瘤作用的分子机制,为PAB的进一步开发和临床应用提供理论依据。方法1.PAB对宫颈癌细胞的体外抗肿瘤作用:MTT法检测PAB对宫颈癌细胞增殖活性的影响,Hoechst 33258染色和流式细胞术检测PAB对HeLa细胞凋亡的影响,Transwell小室迁移实验检测PAB对HeLa细胞迁移能力的影响,实时荧光定量PCR检测PAB对HeLa细胞凋亡和转移相关mRNA表达的影响,Western blot法检测PAB对HeLa细胞凋亡和转移相关蛋白表达的影响,细胞线粒体分离试剂盒检测PAB对HeLa细胞中细胞色素C(Cytochrome C,CytC)从线粒体释放的影响。2.PAX2介导PAB对宫颈癌细胞的体外抗肿瘤作用及机制的探索:慢病毒shRNA干扰技术构建PAX2低表达HeLa细胞株,流式细胞术检测PAB和低表达PAX2对HeLa细胞凋亡的影响,Transwell小室迁移实验检测PAB和低表达PAX2对HeLa细胞迁移能力的影响,双荧光素酶报告基因实验检测PAX2与BAX基因的相互作用,染色质免疫共沉淀实验验证PAX2与BAX基因的相互作用,TOPflash荧光活性实验检测PAB对Wnt/β-catenin信号通路的影响,实时荧光定量PCR检测HeLa细胞中凋亡和PAX家族相关mRNA的表达,Western blot法检测HeLa细胞中凋亡、转移、Wnt/β-catenin信号通路和PAX家族相关蛋白的表达。结果1.PAB可时间-浓度依赖地抑制宫颈癌细胞增殖。PAB可浓度依赖地诱导HeLa细胞凋亡并抑制其迁移。PAB对Fas途径中Fas、Caspase-8、NIK mRNA以及ERS凋亡途径中GRP78、Caspase-12、Calpain mRNA的表达均无显著影响,但可促进ERS凋亡途径中CHOP mRNA的表达。PAB可浓度依赖地诱导HeLa细胞中Caspase-3、Caspase-9、BAX、CytC、Apaf-1 mRNA和BAX、CytC、Apaf-1蛋白表达显著增加,并显著抑制BCL-2 mRNA及其蛋白的表达;不同浓度的PAB在蛋白水平上并未对Caspase-3和Caspase-9的前体含量产生显著影响,但是以浓度依赖的方式显著增加了Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的含量。PAB可时间依赖地诱导HeLa细胞线粒体中CytC释放至细胞质。线粒体外膜通透性抑制剂Mdivi-1可逆转PAB诱导的HeLa细胞中BCL-2 mRNA的降低,Caspase-9和BAX mRNA的升高。PAB可浓度依赖地降低HeLa细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达。2.PAB可抑制HeLa细胞中PAX2和PAX8 mRNA的表达,对PAX3、PAX5和PAX7 mRNA的表达无显著影响。PAX2蛋白表达水平在各宫颈癌细胞中由高到低依次为HeLa、SiHa、CaSki、C33A和MS751,且与PAB对各宫颈癌细胞24、48、72 h的IC50均呈负相关。PAB可抑制HeLa细胞中PAX2蛋白的表达,PAB和低表达PAX2均可诱导HeLa细胞凋亡并降低BCL-2、Cyclin D1、Survivin蛋白和升高BAX蛋白的表达;PAB和低表达PAX2均可抑制HeLa细胞迁移并降低MMP2和MMP9蛋白的表达。过表达PAX2与BAX启动子结合,可明显降低HeLa细胞中BAX启动子调控的荧光素酶活性;过表达PAX2可明显抑制HeLa细胞中BAX、Caspase-3 mRNA的表达并促进BCL-2 mRNA的表达,而在过表达PAX2的HeLa细胞中同时过表达BAX可逆转过表达PAX2对BAX、Caspase-3、BCL-2 mRNA的影响。PAB可抑制HeLa细胞中Wnt2、Wnt10b、Wnt13和Wnt14蛋白的表达,对Wnt4、Wnt5a和Wnt11蛋白的表达无显著影响;PAB可明显降低HeLa细胞中β-catenin的转录活性;PAB可升高HeLa细胞中Cleaved Caspase-3/Caspase-3和p-β-catenin/β-catenin的比例,降低PAX2蛋白的表达和p-GSK-3β/GSK-3β的比例;当Tideglusib激活Wnt信号通路时,HeLa细胞中Cleaved Caspase-3/Caspase-3和p-β-catenin/β-catenin的比例降低,PAX2蛋白的表达和p-GSK-3β/GSK-3β的比例升高,而加入PAB后可逆转Tideglusib对HeLa细胞的影响;当IWP-O1抑制Wnt信号通路时,HeLa细胞中Cleaved Caspase-3/Caspase-3和p-β-catenin/β-catenin的比例升高,PAX2蛋白的表达和p-GSK-3β/GSK-3β的比例降低,与PAB对HeLa细胞的影响一致。结论1.PAB抑制宫颈癌细胞增殖,诱导HeLa细胞凋亡并抑制其转移。2.PAB通过线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡。3.PAB抑制HeLa细胞中PAX2的表达,进而诱导HeLa细胞凋亡并抑制其转移。4.PAX2与BAX启动子结合并对BAX的转录进行负调控,进而抑制HeLa细胞凋亡。5.PAB通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低PAX2的表达,解除PAX2对BAX表达的抑制,进而诱导HeLa细胞凋亡。