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目的本研究旨在基于益气活血、化瘀通络法治疗肺痹的理论,探讨经典方剂补阳还五汤治疗肺纤维化的作用及机制。观察补阳还五汤对肺纤维大鼠干预效果以及对细胞上皮-间质转化的影响,并验证补阳还五汤是否通过PI3K/Akt信号通路发挥抗肺纤维化的作用,以期为补阳还五汤治疗肺纤维化提供理论依据。方法1.将SD大鼠144只随机等分为6组(空白组、模型组、激素组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组,每组24只),除空白组外,各组通过气管注入盐酸博来霉素溶液(5mg/kg)建立大鼠肺纤维化模型。造模后第2日开始灌胃,空白组10ml/kg生理盐水灌胃,激素组按5mg/kg甲泼尼龙水溶液灌胃,中药高、中、低剂量按10g/kg、5g/kg、2.5g/kg补阳还五汤水煎剂灌胃,并观察大鼠的一般状态进行记录。在造模后7天、14天、28天取大鼠血清及肺组织,观察大鼠肺组织的病理形态学变化,用酶联免疫方法测定血清中羟脯氨酸的含量,运用Western blot、RT-q PCR技术分别分析大鼠肺组织中ColⅠ、ColⅢ、CTGF蛋白表达水平及m RNA含量、p-Akt蛋白表达变化,评估补阳还五汤对大鼠肺纤维化的作用效果及可能存在的效应机制。2.人肺泡A549上皮细胞TGF-β1刺激建立体外肺纤维化模型,用不同浓度补阳还五汤(0.1、0.5、1、5、10、50、100mg/m L)在不同时间(24h、48h、72h)干预TGF-β1刺激A549细胞后,运用MTT法观察细胞增殖情况。将最佳浓度的补阳还五汤分别干预TGF-β1诱导的A549细胞,运用倒置相差显微镜观察24h时细胞形态学变化;运用免疫荧光染色、Western blot、RT-q PCR技术检测细胞中Vimentin、E-cadherin、ColⅠ72h时阳性染色率、蛋白表达水平及24h时m RNA含量变化,以探究补阳还五汤体外实验对人肺泡上皮细胞向间质细胞转化的影响。3.用10mg/m L浓度的补阳还五汤干预TGF-β1诱导后的A549细胞,1h后检测细胞中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt的蛋白水平。进一步再行10mg/m L补阳还五汤干预IGF-I和SC79分别诱导的A549细胞,分别检测1h时细胞中p-PI3K、p-Akt的蛋白水平,比较以探讨补阳还五汤抑制PI3K/Akt通路干预细胞上皮间质转化作用的靶点。结果1.补阳还五汤治疗博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型后,较模型组7天时大鼠反应稍迟钝,精神尚可;大鼠肺表面点状瘀血现象减少;肺泡壁稍增厚;肺纤维化程度积分降低(P<0.05);大鼠的血清中羟脯氨酸和ColⅠ、ColⅢ蛋白的含量均下降,肺组织中CTGF蛋白表达水平及m RNA基因含量降低,且在高、中浓度的补阳还五汤组最为明显(P<0.05);低浓度补阳还五汤组的肺组织中pAkt蛋白水平明显下降(P<0.05)。较模型组14天时大鼠反应速度增加,喘鸣音减少;大鼠肺表面稍粗糙,瘀斑点减少;肺泡结构恢复,炎性细胞减少;肺纤维化程度积分降低(P<0.05);大鼠的血清中羟脯氨酸和ColⅠ、ColⅢ蛋白的含量均显著下降(P<0.05);而肺组织p-Akt、CTGF蛋白表达水平下调,CTGFm RNA基因含量降低,且在高、中浓度的补阳还五汤组最为明显(P<0.05)。较模型组28天时大鼠精神好转,紫绀现象减轻、体重增加;大鼠肺表面白色结节减少;肺泡结构趋于正常,纤维细胞减少;肺纤维化程度积分显著降低(P<0.05);大鼠的血清中羟脯氨酸和ColⅠ、ColⅢ蛋白的含量均显著下降,在中、低浓度的补阳还五汤组最为明显(P<0.05);而肺组织p-Akt蛋白表达水平下调,CTGFm RNA基因含量显著降低(P<0.05),且在高、中浓度的补阳还五汤组最为明显但均高于空白组,补阳还五汤各组CTGF蛋白表达水平无统计学意义。2.补阳还五汤1、5、10mg/m L为最佳的实验浓度,均可促使TGF-β1诱导的人肺泡上皮A549细胞样形态向梭形转变、细胞间界限缩小;与模型组比较,补阳还五汤组细胞中ColⅠ和Vimentin蛋白水平、阳性染色率及m RNA的含量显著下降(P<0.05),并且E-cadherin蛋白水平、阳性染色率及m RNA含量明显上调,且在5、10mg/m L浓度组最为显著(P<0.05)。3.补阳还五汤10mg/m L分别干预TGF-β1、IGF-I、SC79组刺激的人肺泡上皮细胞1h后,与TGF-β1模型组比较,细胞p-PI3K和p-Akt蛋白的表达显著下调(P<0.05);与IGF-I模型组比较,细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表达可显著下调(P<0.05);与SC79模型组比较,细胞中p-Akt蛋白表达可显著下调(P<0.05)。结论1.补阳还五汤可以有效干预博来霉素刺激的大鼠肺纤维化进程,其机制可能与影响PI3K/Akt通路有关。2.补阳还五汤能有效抑制TGF-β1刺激的A549细胞上皮-间质转化及细胞外基质沉积,其作用可能是通过PI3K/Akt通路中PI3K、Akt靶点,干预肺纤维化进展。