论文部分内容阅读
萜类化合物MEP生物合成途径为人们提供了一个利用该途径的关键酶为靶标进行抗菌素筛选的强有力的方法。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶（DXR）是MEP生物合成途径中的关键酶之一,在辅酶NADPH的存在下可以将DXP还原为MEP。鉴于DXR特定的性能,它正成为人们设计新型药物的重要靶标。这主要是因为包括人类致病菌在内的大多数细菌都是通过MEP途径来合成他们自身所需的萜类化合物,而在人体内并没有发现DXR及其类似物的存在。因此,本研究内容之一就是通过基因工程方法得到MEP途径中的关键酶DXR,同时对该酶进行了活性分析。本研究以大肠杆菌基因组DNA为模板,经PCR方法扩增出编码DXR的基因dxr,克隆入pET-15b载体中,构建重组表达载体pET15b-DXR,对获得的pET15b-DXR重组质粒扩增后进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定完全正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Westernblotting鉴定。SDS-PAGE分析出现一条约42 kDa的条带,与预期融合蛋白的分子量相符,Western-blotting显示诱导后的菌体在相应的位置处出现特异性的杂交带,最后进行大量诱导并纯化,得到了目的蛋白,产率10 mg/L、纯度超过95%。用此融合蛋白作为生物酶催化剂,该酶可以催化DXP向MEP转化。环烯醚萜苷类化合物是一类特殊的单萜化合物,是一些植物的自身防御物质,具有广泛的生物活性,也是很多植物药中的有效成分。唇形科野芝麻属植物野芝麻全草富含环烯醚萜苷类化合物。本研究内容之二就是以野芝麻为研究对象,用C-13标记的萜类化合物生物合成的MEP途径中重要中间体[3,4,5-13C3]DXP为原料对该植物进行了喂饲实验。通过分析喂饲后野芝麻中环烯醚萜苷类化合物caryoptoside及lamalbid的C-13标记位置及[3,4,5-13C3]DXP的转化量,证实了该植物中环烯醚萜苷类化合物是通过萜类化合物生物合成的MEP途径合成的。