蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor,PI)是一类抗营养物质,广泛存在于植物中,因具有抑制蛋白酶活性的功能而被认为是一类天然抗虫物质。Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(Kunitz-type trypsin inhibitor,KTI)是PI四大家族之一丝氨酸蛋白酶中最具有代表性的KTI,其最重要的生理功能是保护植物个体免受昆虫和病原体侵害,其作用机制主要是抑制昆虫中肠消化蛋白酶(以胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶为主)的活性,导致昆虫不能对食物进行正常消化、吸收,进而使其生长发育受阻。黑杨(Poplus nigra)是多年生木本植物,具有12个机械损伤诱导表达的KTI基因(PnKTIs)。本课题为研究PnKTIs基因是否具有保护植物个体免受或者少受害虫侵害的功能,以及各基因表达后的抗虫效果,选择了4个高度诱导表达的PnKTIs基因(PnKTIA6、PnKTIB1、PnKTIC1和PnKTID2)作为目标基因,通过转基因技术手段将这四种基因转化到拟南芥中,经实时定量PCR确认目标基因在拟南芥中过量表达后,选用新鲜转基因拟南芥叶片饲喂小菜蛾,观察小菜蛾从幼虫到成虫整个生长发育阶段中的变化,记录生长发育周期中的各项生理指标。结果表明,四种PnKTIs基因的表达蛋白均对小菜蛾的生长发育表现出一定的抑制作用,其中作用效果最好的为PnKTIA6,其他依次为PnKTID2、PnKTIB1和PnKTIC1。为进一步探究PnKTIs基因的表达蛋白(PnKTIs)是通过抑制昆虫体内何种消化蛋白酶来行使其功能的,本研究使用酶化学法,将转基因拟南芥叶片的蛋白提取液分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶反应,判断分析四种PnKTIs对不同蛋白酶的抑制活性。结果发现,PnKTIs仅对胰蛋白酶表现出抑制作用,且四种PnKTIs对胰蛋白酶抑制的作用效果依次为:PnKTIA6、PnKTID2、PnKTIB1和PnKTIC1,此结果和转基因抗虫试验的作用效果是一致的。综上,本研究为转基因抗虫植物提供了可供选择的候选基因,对农林业的虫害防治具有一定的指导意义。