凋亡诱导因子(AIF)在小鼠毛囊周期中的表达调控研究

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目的本研究旨在探究凋亡诱导因子(Apotosisi inducing factor, AIF)是否在小鼠毛囊组织中表达以及该表达对毛囊周期、特别是退行期毛囊细胞凋亡的影响,为毛囊生物学研究提供理论依据,也为毛发相关疾病的治疗提供潜在的思路。方法首先我们通过酶消化法从C57BL/6小鼠背部皮肤组织中分离得到了纯净的毛囊组织,并以此为原料,从中提取总RNA和蛋白质。首先应用PCR和Westernblot等技术,检测AIF是否在毛囊组织中表达,并进一步应用免疫组织化学染色法确定AIF在小鼠毛囊组织中的表达定位,其次通过免疫荧光染色检测AIF和亲环素A(Cyclophilin A,CypA)在毛囊细胞凋亡(TUNEL染色)过程中的时空表达及其与Caspase信号之间的关系。此外,通过PCR法检测膜受体通路相关凋亡因子在毛囊周期中mRNA水平的表达变化。最后我们通过小鼠腹腔注射Cyclosporine A、Caspase3Inhibitor (Ac-DEVD-CHO)和Calpain Inhibitor I等三种线粒体凋亡信号通路抑制剂,通过Western blot法从蛋白质水平上检测并分析了Caspase级联信号和AIF信号之间的调控关系。结果PCR和Western blot结果显示AIF在小鼠毛囊组织中呈阳性表达。免疫组织化学染色结果显示AIF表达于小鼠毛囊的外毛根鞘、内毛根鞘、毛乳头及隆突部位,另外在小鼠皮肤的表皮、皮脂腺、皮下肌肉层中也呈阳性表达。此外,PCR结果显示膜受体通路凋亡因子TRAIL、TNF-α和Fas L在转录水平上也参与调控毛囊周期。TUNEL和AIF/CypA共染结果发现AIF和CypA在生长期和退行期大量进入毛囊细胞核中,同时发现TUNEL阴性的细胞中AIF和CypA也大量的进入细胞核。最后给小鼠注射CyclosporineA、Caspase3Inhibitor (Ac-DEVD-CHO)和Calpain Inhibitor I三种抑制剂,结果发现前两者能够有效延迟Catagen,但不能阻断Catagen,后者既不能延迟也不能阻断Catagen,通过Western blot结果发现CyclosporineA可以抑制Caspase信号级联同时阻断AIF信号入核,Caspase3Inhibitor (Ac-DEVD-CHO)可以阻断Caspase3同时激活AIF信号通路;而CalpainInhibitor I可以阻止AIF从线粒体释放同时激活Caspase级联信号。结论(1)AIF在小鼠毛囊组织中表达,其表达部位包括小鼠毛囊的外毛根鞘、内毛根鞘、毛乳头及隆突部位。(2)AIF进入毛囊细胞核切割DNA事件的发生早于Caspase3的激活,AIF是毛囊细胞凋亡生物学行为的早期调控因子。(3)Cyclosporine A和Caspase3Inhibitor (Ac-DEVD-CHO)可以有效延迟毛囊退行期,但不能阻止退行期的到来;Calpain Inhibitor I可以抑制AIF信号通路,但同时激活Caspase信号级联。(4)非Caspase信号通路即AIF通路和Caspase级联信号通路相辅相成、互相弥补。(5)毛囊的退行是细胞膜表面凋亡受体信号通路和内源性线粒体通路,以及Caspase级联信号通路和非Caspase信号即AIF通路协同调控的结果。
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