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目的:1.研究血流感染中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的临床感染流行特征、危险因素、耐药性及毒力特征。2.研究血流感染中共携带KPC-2质粒和pLVPK样毒力质粒耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的临床感染流行特征、耐药性、毒力特征和分子流行病学。3.研究高毒力肺炎克雷伯菌毒力质粒与高毒力表型之间的关系及其转移性。方法:1.收集2016年6月-2019年6月南昌大学第一附属医院血流感染患者中的肺炎克雷伯菌248株,采用Vitek2-Compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定和药敏实验。在医院的病例系统查询临床资料,采用PCR和测序方法检测菌株的耐药基因、荚膜血清型基因和毒力基因。通过药敏资料将菌株分为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）和碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）。通过SPSS21分析CRKP组和CSKP组的临床资料、药敏资料、耐药基因、荚膜血清型基因和毒力基因,得出血流感染中CRKP的临床感染特征、危险因素、耐药特征及毒力特征。2.从第一部分的菌株中,通过KPC-2基因及pLVPK样毒力质粒相关基因初步筛选,再通过S1-PFGE和southern blot实验筛选出24株共携带KPC-2质粒和pLVPK样毒力质粒的CRKP。在医院的病历系统查询临床资料;采用PCR和测序检测菌株的耐药基因、荚膜血清型基因和毒力基因;通过S1-PFGE和southern blot实验对KPC-2质粒和pLVPK样毒力质粒进行定位;MLST分型、WZI分型和PFGE分析菌株的亲源性;蜡螟幼虫感染模型分析菌株的毒力。3.对第一部分菌株回顾性基因组研究筛选出高毒力肺炎克雷伯菌AP8555,并对其进行全基因组测序,分析染色体和毒力质粒基因组学,并与已经完成测序的菌株基因组进行比较,接合实验分析毒力质粒的转移性,并通过结晶紫法测定其生物膜形成能力,血清抗性试验、蜡螟幼虫感染模型以及体外感染小鼠致死实验的结果来反映其毒力。结果:1、多因素logistic回归分析显示入住ICU、肾脏疾病、烧伤、机械通气、留置导尿管、留置引流管、碳青霉烯类抗生素使用和替加环素使用是碳青霉烯类抗生素耐药的独立危险因素（P<0.05）。血流感染中CRKP组患者死亡率（53.42%）明显高于CSKP组患者（10.86%）,且有显著性差异（P<0.05）。除对氨苄西林天然耐药外,CRKP组对其它15种抗生素的耐药率均大于CSKP组,且有显著性差异（P<0.001）。73株CRKP菌株中69株KPC基因阳性,阳性率为94.5%;4株NDM基因阳性,阳性率为5.5%;其中有1株同时携带KPC和NDM基因;另有1株未检测到这5种碳青霉烯酶基因。CRKP BSI组检出3株K1型,1株K2型,1株K20,2株K54。2.从第一部分248株血流感染患者中筛选出24株共携带KPC-2质粒和pLVPK样毒力质粒的CRKP。多数患者长期住院,使用多种抗菌药物治疗和死亡率高（66.7%）。所有菌株均具有多重耐药性和携带多种毒力基因。MLST和PFGE结果表明,有四个PFGE分型,其中A型（n=21,87.5%）属于ST11,其余三个分离株（ST412,ST65,ST23）具有不同的PFGE分型（B、C、D型）。携带blaKPC-2基因的质粒大小在100kb至390kb之间。19株（79.2%）菌株携带219kb毒力质粒,与血清型K2的CG43的pLVPK具有高度相似性。2株菌株具有与来自肺炎克雷伯菌NTUH-K2044（ST23）的质粒pK2044相似的224kb毒力质粒。此外,有3株菌株携带3种不同的毒力和耐药杂交质粒。蜡螟幼虫感染中的感染分析表明,所有菌株的毒力水平始终高于经典肺炎克雷伯菌（cKP）。在这24株菌株中,有15株菌株毒力水平与高毒力标准菌株NTUH-K2044相似（P>0.05）,但有9株菌株毒力比高毒力标准菌株NTUH-K2044低（P<0.05）。3.对第一部分菌株回顾性基因组研究筛选出高毒力肺炎克雷伯菌AP8555.AP8555菌株是携带一种新型毒力质粒的ST23型hvKP菌株,该菌株在危重病人中引起了转移性感染和致命的败血性休克。蜡螟幼虫感染显示接种1×106 cfu菌株在36小时内杀死100%的蜡螟幼虫。小鼠致死实验显示小鼠LD50为2.5×102cfu,表现出高毒力表型。结合实验表明该毒力质粒能以约3.2×10-4的频率转移到受体菌大肠杆菌J53。全基因组测序结果表明,AP8555由一条5.46Mb染色体和一个大毒力质粒组成。毒力质粒pAP8555的大小为357.8kb,除了编码IV型分泌系统（T4SS）成分和毒素抗毒素（TA）系统同源物的额外130kb区域外,与先前报道的各种已知的pLVPK样质粒在结构上几乎相似。结论:1.本院血流感染中CR-KP菌以KPC为主,但也存在NDM的流行。CRKP菌株多重耐药情况严重,患者的病死率高,并且出现高毒力血清荚膜分型。临床应针对CRKP BSI独立危险因素,加以干预和控制。2、血流感染中共携带KPC-2质粒和pLVPK样毒力质粒CRKP菌株具有患者死亡率高、多重耐药性和增强的毒力。有3株菌株携带毒力和耐药杂交质粒,或将存在毒力和耐药共传播。我们应该不仅对特定的菌株进行追踪,而且应该对毒力和耐药质粒（和基因）进行追踪,实施控制策略和感染预防,以控制其在医院的传播。3.AP8555菌株是携带一种新型毒力质粒的ST23型hvKP菌株,表现出高毒力表型,其毒力质粒上含毒素抗毒素（TA）系统和IV型分泌系统,并且该毒力质粒具有转移性。加强对毒力质粒的获取对于了解毒力质粒在肺炎克雷伯菌中的潜在传播至关重要。