研究背景呼吸道感染(RTI)是引起人类发病和死亡的主要原因之一,给人类的健康带来威胁同时增加社会经济负担。呼吸道感染分为上呼吸道感染(URTI)和下呼吸道感染(LRTI),常见病原体有病毒、细菌、真菌等,随着抗生素的发现和不断应用,细菌感染引起的呼吸道疾病基本可以得到有效控制,而病毒引起的呼吸道感染目前仍缺乏特效药物。可引起呼吸道感染的常见病毒包括流感病毒(IFV)、人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、人冠状病毒(HCo V)、腺病毒(ADV)、人偏肺病毒(HMPV)和人博卡病毒(HBo V)等。人冠状病毒感染引起的呼吸道症状严重程度差别很大,可以是轻微的上呼吸道感染症状如流涕、咳嗽、发热等,也可以是严重的下呼吸道感染症状如肺炎、支气管炎、毛细血管炎等,甚至可以引起呼吸衰竭而死亡。已发现可致病的人冠状病毒有六种:HCo V-NL63、HCo V-229E、HCo V-OC43、HCo V-HKU1、SARS-CoV和MERS-Co V。HCoV-NL63、HCo V-229E、HCo V-OC43、HCo V-HKU1主要引起轻度的呼吸道感染症状,其感染情况依地域、季节、患者年龄、免疫功能和基础疾病等不同而有差异。2003年出现的新型冠状病毒SARS-CoV在广州地区爆发并迅速蔓延世界多个国家,造成8000多人感染,900多人死亡,死亡率达10%以上,2012年在中东地区出现的另一新型冠状病毒mers-cov,截止目前全球mers-cov感染人数约1599人,死亡约574人,死亡率近40%。sars-cov和mers-cov的出现揭示了cov作为潜在且危害性极高的人兽共患传染病病原体,具有在人群中产生爆发流行的重大可能,因此对人与动物宿主体内cov的流行分布情况进行监测具有重要意义。对上呼吸道感染人群中hcov的流行分布情况进行持续监测,可为hcov感染的流行病学调查和防治提供重要的科学依据,而对hcov的进化变异情况进行分析研究可为传染病防治策略的制定和传染病的预警提供重要的参考。本课题组近年来对广州地区hcov的流行现状和主要亚型的分布进行了持续监测,在此基础上,本研究收集了2010年7月至2015年7月广州地区14家哨点医院的13048份呼吸道感染患者的鼻咽拭子标本,采用real-timepcr方法对其进行总冠状病毒及亚型的核酸检测,并对2013年至2014年部分hcov-oc43阳性标本的易突变基因s基因进行了扩增测序和变异分析,了解广州市hcov及其主要亚型的流行状况和hcov-oc43亚型近两年进化变异特征。研究目的1、了解2010-2015年广州地区发热呼吸道感染人群中hcov及其亚型感染的流行病学特征。2、分析2013-2014年广州地区hcov-oc43亚型s基因的进化变异特点,为hcov-oc43的变异规律研究提供参考依据。研究方法1、收集2010年7月至2015年7月广州市中山大学附属第一医院、中山大学附属第二医院、中山大学附属第三医院、广东省人民医院、广东省中医院、广东省疾病预防控制中心、暨南大学附属华侨医院、广州市妇女儿童医院、广州市红十字会医院、广州市疾病预防控制中心、广州医学院附属第一医院、广州医学院附属荔湾医院、广州医学院附属呼吸病研究所、南方医科大学附属珠江医院共14家哨点医院符合病例纳入标准的发热呼吸道感染患者鼻咽拭子标本,置于病毒转运液中低温转运至传染病技术监测平台华南地区实验室,处理分装后-80℃保存。2、采用real-timepcr方法检测样本中hcov及各亚型感染情况,对hcov阳性标本同时检测流感病毒(ifv)、副流感病毒(piv)、鼻病毒(hrv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、偏肺病毒(hmpv)、博卡病毒(hbov)和腺病毒(adv)等7种常见呼吸道病毒核酸以了解混合感染情况。3、结合患者病历信息,分析hcov及各亚型的人群、季节、年龄等分布特点。4、取2013-2014年15例hcov-oc43阳性标本,采用rt-pcr方法扩增标本部分s基因片段并进行测序,利用mega5.0、clustalx、seqman等软件对s基因序列进行拼接,并与genbank数据库中各地不同基因序列进行比对分析,绘制系统进化树,了解近两年广州地区hcov-oc43亚型进化变异特征。研究结果1、2010年7月至2015年7月期间共收集鼻咽拭子标本13048份,其中男性病例7974份,女性病例5074份,男女比例1.57;住院病例8518份,门急诊病例4530份;住院病例中男性5453份,女性3065份,男女比例1.78;门急诊病例中男性2521份,女性2009份,男女比例1.25。2、13048份标本中hcov检测为阳性的标本294份,阳性检出率2.25%。阳性标本中男性192例,检出率为2.41%,女性102例,检出率为2.01%;住院病例251例,检出率为2.95%,门急诊病例43份,检出率为0.95%。3、hcov阳性标本中共检出hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-hku1四种亚型,其中hcov-oc43177例、hcov-229e49例、hcov-nl6344例、hcov-hku123例,检出率分别为1.36%(60.20%)、0.38%(16.67%)、0.34%(14.97%)、0.18%(7.82%),此外检出1例hcov-hku1、hcov-oc43共感染病例,所有标本中均未检出sars-hcov、mers-cov亚型。4、从年份分布上来看,2010-2015年期间总hcov检出率分别为0.21%、3.47%、2.91%、4.16%、2.07%,hcov及各亚型在2010年检出率均较低,之后检出率较大程度增高并在各年份间呈现交替流行趋势。hcov-oc43和hcov-229e在2010年检出率最低,2011年升高,2012年再次降低,2013年出现流行高峰,2014年再次降低,呈现明显的交替流行现象;hcov-nl63检出率在2010-2012年逐年升高,2012年后检出率又逐年降低,在2012年出现检出率最高峰;hcov-hku1在2010-2012年检出率逐年升高,流行高峰在2012年,2013年检出率减低,2014年又有上升趋势。从各亚型的季节分布来看,hcov-oc43各季节发病率差异不大;hcov-229e各季节发病率差异明显,春季最高(0.67%),秋季最低(0.11%);hcov-nl63主要在秋冬季高发;hcov-hku1在春季发病率最高(0.46%),冬季无阳性标本检出。5、从各亚型的年龄分布来看,亚型hcov-oc43检出率最高年龄组为0-3岁婴幼儿(2.03%);hcov-229e在各年龄组的的分布呈不集中趋势,但是最低发年龄组为50-65岁的中老年人(0.13%);50-65岁的中老年人是亚型hcov-hku1阳性率最高的年龄组(0.67%);hcov-nl63在较大年龄组发病率明显高于低年龄组,其中在35-50岁中年人中发病率最高。101例标本混合感染了至少一种其他呼吸道病毒,混合感染率为34.35%,最常混合感染的病毒为流感病毒。6、对2013-2014年hcov-oc43亚型s基因的分子变异情况进行系统进化树分析发现,2013-2014年期间,广州地区hcov-oc43主要流行株分为两群,其中一群与北京(gi:744516692)、法国(gi:721684917)、比利时(gi:62528991)来源株亲缘关系较近;另外一群与法国地区(gi:721684923)来源株亲缘关系较近,进一步基因型分型结果显示,广州地区2013-2014年流行有两群oc43病毒株,一群属于b基因型,另外一群不属于已鉴定出的任何一种基因型,可能为新的基因型,命名为e型。研究结论1、2010-2015年期间广州地区hcov的检出率为2.25%,男女比例1.88,2013年为流行高峰年,四季检出率无明显统计学差异,主要感染0-3岁婴幼儿和50-65岁及以上中老年人,混合感染以流感病毒最常见,混合感染患者临床症状与单独感染患者无明显差异。2、广州地区hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-huk1四种亚型检出率依次为1.36%、0.38%、0.34%和0.18%。hcov-oc43为最常见亚型,检出率无明显季节差异,主要感染0-3岁婴幼儿;hcov-229e多见于春季,各年龄组无明显差异;HCo V-NL63主要流行于秋冬季和35-50岁年龄组;HKU1在2012年出现了一个小的流行高峰,主要在春季流行,50-65岁年龄组检出率最高。3、2013-2014年广州地区HCo V-OC43流行株与北京和法国地区发现的某些株亲缘关系相近,基于S基因分型系统进化树来看主要分为两支,一支归属于OC43基因型B型,另外一支不属于已存在的基因型,可能为新亚型。