原癌基因C-met在食管鳞癌中的表达及其与COX-2表达相关性以及COX-2基因表达与细胞增殖、凋亡相关性研究目的食管癌是消化道常见恶性肿瘤之一,其发病过程中存在许多原癌基因的激活。C-met是一种由C-met原癌基因编码的蛋白产物,为肝细胞生长因子受体,具有酪氨酸激酶活性,与多种癌基因产物和调节蛋白相关,参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控,是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前研究表明,C-met基因与多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关,许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有C-met的过度表达和基因扩增。当前国内外文献食管鳞癌中C-met表达情况报道较少,因此,本实验通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription -polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测57例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met mRNA的表达,并分析C-met mRNA的表达与临床病理资料之间的关系；同时采用免疫组织化学方法检测了57例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met蛋白及COX-2蛋白的表达,并探讨C-met蛋白与COX-2蛋白之间的关系。本研究还应用流式细胞术,对食管鳞癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检验分析,希望证实COX-2表达与食管肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。材料与方法一、实验材料57例食管鳞癌手术标本及部分相应的癌旁正常食管组织标本20例来自山东大学省立医院胸外科2008年11月-2009年12月间的手术病例,其中男性46例,女性11例,年龄34～72岁,中位年龄52.9岁。57例肿瘤组织中,13例低分化,28例中分化,16例高分化,26例有淋巴结转移。肿瘤部位中段28例,下段29例。肿瘤大小≤5cm32例,>5cm25例。根据国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的食管癌临床分期标准,Ⅱa期31例,Ⅱb+Ⅲ期26例,食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手术范围内。胸腹部淋巴结清扫范围参照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)食管癌淋巴结分布图,淋巴结清扫数目7-22枚,平均9.6枚。所有患者术中肉眼大体判断均达RO切除,术后病理诊断食管鳞癌,食管上、下切缘均无肿瘤细胞残留。相应的癌旁正常食管组织标本为术中采集距离食管癌组织至少5cm以上的正常食管组织。所有患者术前均未行放、化疗治疗。二、实验方法1、逆转录PCR检测C-met基因表达取100mg待检验组织,加入1ml Trizol溶液彻底匀浆。参照Trizol试剂盒说明书用一步法提取总RNA,用DNA/RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中加入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl2 2μl、Random 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、Reverse Transcriptase 0.5μl、ddH2O 3.75μl。反应条件：30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。C-met基因引物序列为5’ - TTCACCGCGGAAACACCCATC -3’(上游)和5’-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT -3’(下游)。在12.5μ1反应体系中含有灭菌ddH2O 7.16μl、20pmol/L上、下游引物各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl。反应条件：95℃2min,95℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环；72℃延伸7min。用内参照β-肌动蛋白(β-actin)检测逆转录效率。PCR产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,100V,1.5h,电泳结束后,凝胶自动成像仪进行摄像分析。采用TaKaRa公司100bp梯度Makers为分子量大小对照,确定电泳条带。2、免疫组织化学方法检测C-met、COX-2蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫组织化学方法,一抗C-met和COX-2兔抗人多克隆抗体(美国BIOCHEMICALS公司产品),工作浓度1：100,S-P试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。胞浆染色为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志,将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级：弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)。3、流式细胞术检测食管鳞癌细胞的增殖活性和凋亡水平取材深低温保存的组织,采用网挫方法制备单细胞悬液,以PBS调整细胞数为1×106/m1。其中一份加入PI染色液lml(PI染色液包含PI 5mg, Rnase 2mg, TritonX-100ml,生理盐水65m1,枸椽酸钠100mg,加蒸馏水至100m1),置4℃冰箱中避光染色30min后进行分析。另一份加入FITC-AnnexinV及PI各5μ1,室温下避光静置15min后进行分析。使用的流式细胞仪为FACSCalibur型(B.D,USA)。光源为488nm氩离子激光器,FITC受激发后发绿色荧光,PI发红色荧光,每份标本计数10000个细胞,然后在Macintosh 9.5计算机上用相关软件分析数据。测量前,以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CV值在3.0%以内。应用MetaMorph (CellQuest3.0)细胞周期分析软件,计算DNA组方图各时相分布的百分比,以增殖指数(proliferation index, PI)表示增殖活性。二维点阵图上FITC高染而PI低染者为早期凋亡细胞,计算其所占的百分比。三、统计学分析计数资料采用X2检验,计量资料采用t检验,用SPSS13.0软件处理。结果1、C-met基因在食管鳞癌组织中的表达情况C-met基因在57例食管鳞癌组织中阳性表达率为52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管组织中低表达,阳性率为5.0%(1/20),两者之间有显著性差异(P<0.01)。2、C-met基因的表达与食管鳞癌组织临床病理资料的关系C-met基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关(P>O.05),而与鳞癌组织浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.01)。3、食管鳞癌组织中C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达的相关性C-met蛋白在57例食管鳞癌组织中阳性表达率为52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管组织中低表达,阳性率为5.0%(1/20),两者之间有显著性差异(P<0.01)。在食管鳞癌组织中,C-met蛋白的表达与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关,而与患者年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关(P>0.05)。COX-2蛋白在57例食管鳞癌组织中有40例阳性表达(阳性率为70.2%),而20例癌旁正常组织仅1例呈阳性表达(阳性率为5.0%),两者之间有显著性差异(P<0.01)。在食管鳞癌组织中,COX-2蛋白的表达与淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05),而与患者年龄、性别、病变长度、癌组织浸润深度和组织分化程度无关(P>0.05)。30例C-met蛋白表达阳性的食管鳞癌组织中有26例COX-2蛋白阳性表达,27例C-met蛋白表达阴性的食管鳞癌组织中有14例COX-2蛋白呈阳性表达,经统计学检验分析,C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达呈正相关(r=0.436,χ2=8.203,P=0.004)。4、食管鳞癌组织中COX-2基因表达与肿瘤细胞增殖的相关性通过免疫组织化学方法检测的57例食管鳞癌组织的细胞增殖指数(PI)平均为(30.14±4.99)%。57例患者中40例COX-2蛋白阳性表达,17例COX-2蛋白阴性表达,食管鳞癌细胞增殖指数(PI)分别为(31.41±5.14)%和(27.15±4.66)%,两者比较有显著性差异(t=6.933,p<0.01)。5、食管鳞癌组织中COX-2基因表达与肿瘤细胞早期凋亡的相关性通过免疫组织化学方法检测的57例食管鳞癌组织的早期凋亡率平均为(2.18±0.78)%。57例患者中40例COX-2蛋白阳性表达,17例COX-2蛋白阴性表达,食管鳞癌细胞早期凋亡率分别为(1.97±0.71)%和(2.66±0.94)%,两者比较有显著性差异(t=4.831,,p<0.01)。结论1、C-met基因在食管鳞癌中呈高表达,而在癌旁正常食管组织中低表达。2、C-met基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关,而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关。3、COX-2基因在食管鳞癌中呈高表达,而在癌旁正常食管组织中低表达。4、COX-2基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度、癌组织浸润深度和组织分化程度无关,而与淋巴结转移和TNM分期有关。5、食管鳞癌组织中C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达密切相关。6、食管鳞癌组织COX-2基因表达与肿瘤细胞增殖有关。7、食管鳞癌组织COX-2基因表达与肿瘤细胞早期凋亡有关。