前言：　　 分泌型卷曲相关蛋白(secretedfrizzledrelatedproteins,SFRPs)是一种分泌型糖蛋自家族,由SFRP基因编码。目前研究发现哺乳动物SFRPs家族主要包括SFRP1-5。SFRPs通过竞争性抑制Fz受体而抑制Wnt的活动,是Wnt信号通路的抑制因子。目前有大量的研究显示在肿瘤细胞中SFRPs基因启动子区域存在甲基化,导致SFRPs蛋白表达缺失或下调,对Writ信号通路的抑制作用减弱,从而促进肿瘤的形成与发展。SFRP5是SFRPs家族的一个分泌型蛋白,基因定位在10q24.1。目前对SFRP5的功能研究主要集中在三个方面:第一,SFRP5参与胚胎发育早期细胞极性及器官形成。第二,SFRP5参与肥胖形成的调节。第三,在某些肿瘤中存在SFRP5基因启动子区甲基化,但这种改变在肿瘤发生发展中的作用尚不明确。有研究显示SFRP5基因甲基化与卵巢癌对顺铂的耐药有关。另有研究表明SFRP5基因甲基化导致的SFRP5蛋白表达下降可能增加急性髓系白血病复发的风险。这些研究提示SFRP5在肿瘤的多药耐药形成过程中可能发挥一定的作用。　　 多药耐药(multidrugresistance,MDR)白血病细胞的存在是白血病复发及难治的关键。由多药耐药基因(multidrugresistancegene-1,mdr1)编码的P-糖蛋白(P-glyeoprotein,P-gp)过表达造成抗癌药物外排增加,药效降低是多药耐药形成的主要原因。有研究显示激活Wnt/β-catenin信号通路能够引起β-catenin下游靶基因mdr1转录增加。因此我们推测作为。Wnt的抑制因子,SFRP5蛋白可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节P-gp介导的白血病MDR。本研究检测了白血病细胞中SFRP5的甲基化状态及蛋白表达情况,验证了SFRP5对mdr1/P-gp的调节作用,并探索其信号传导通路。通过本研究进一步阐明了SFRPs家族在肿瘤发病中的作用,并为多药耐药白血病的治疗提供新的靶点。　　 实验材料与方法：　　 一、SFRP5在白血病中的基因甲基化及蛋白表达情况　　 1、采用甲基化特异性PCR(MSP)方法对白血病患者及细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态进行检测。　　 2、采用亚硫酸盐测序PCR(BSP)方法对白血病细胞系KGla中SFRP5基因启动子区甲基化状态进行分析。　　 3、采用Westernblot方法检测SFRP5蛋白在白血病患者及细胞系中的表达。　　 二、SFRP5通过Wnt/β-catenin信号通路调节白血病mdr1/P-gP表达　　 1、采用Westernblot检测非磷酸化β-catenin在白血病患者及细胞系中表达。　　 2、采用RT-PCR检测mdr1mRNA在白血病患者及细胞系中的表达。　　 3、采用Westemblot检测P-gp在白血病患者及细胞系中的表达。　　 4、使用去甲基化试剂DAC处理P-gp阳性白血病标本,恢复SFRP5表达。采用Westernblot检测处理后P-gp水平,real-timePCR检测处理后mdrlmRNA表达。　　 三、恢复SFRP5表达以逆转白血病Kgla细胞多药耐药性的研究　　 1、采用转基因方法构建过表达SFRP5的KG1a/SFRP5细胞及表达绿色荧光蛋白的KGla/eGFP细胞作为对照。　　 2、采用real-timePCR检测KG1a,KG1a/eGFP及KGla/SFRP5细胞mdr1mRNA表达。　　 3、采用Westernblot检测KG1a,KG1a/eGFP及Kgla/SFRP5细胞P-gp表达。　　 4、应用免疫荧光显微镜观察KG1a,KG1a/eGFP及Kgla/SFRP5细胞膜表面P-gp表达。　　 5、采用流式细胞仪检测KGla,Kgla/eGFP及KGla/SFRP5细胞内药物浓度。　　 6、采用MTT方法检测KGla,KGla/eGFP及KGla/SFRP5细胞耐药性。　　 结果：　　 一、SFRP5在白血病中的基因甲基化及蛋白表达情况　　 1、采用MSP方法对12例白血病患者(L1-L12),6例正常标本(N1-N6)及4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937和KGla)的SFRP5基因甲基化状态进行检测。结果显示,在12例患者标本中有7例(L2、L4、L5、L6、L7、L8、L11)发生了SFRP5基因甲基化,其中L5和L6发生了部分SFRP5基因甲基化,而6例正常标本均未发生SFRP5基因甲基化。4种白血病细胞系中均发生SFRP5基因甲基化。　　 2、采用BSP方法对Kgla细胞中SFRP5基因-394bp到+99bp位点的CpG甲基化状态进行分析。检测长度494bp,共设计两对引物对该片段进行检测。结果显示P1片段长度为224bp,存在10个CpGs,总甲基化频率为85.0%。P2片段长度为270bp,存在32个CpGs,总甲基化频率为80.0%。　　 3、采用Westernblot方法检测SFRP5蛋白在12例患者标本(L1-L12),6例正常标本(N1-N6)及4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937和KG1a)中的表达情况。结果显示所有6例正常标本均存在SFRP5蛋白表达。在白血病患者标本中有7例发现SFRP5蛋白表达,而其余5例则未检出SFRP5蛋白表达。4种白血病细胞系中均未检测到SFRP5蛋白表达。使用去甲基化试剂DAC处理上述4种细胞系,结果显示均恢复SFRP5表达。　　 二、SFRP5通过Wnt/β-catenin信号通路调节白血病mdr1/P-gp的表达　　 1、采用Westernblot检测非磷酸化β-catenin(NP-β-catenin)在SFRP5表达阴性的患者标本(L2、IA、L7、L8、L11)、及4种白血病细胞系中的表达状态。结果显示在5例SFRP5表达消失的患者标本中,有3例(L2、L7、L8)NP-β-catenin水平高于其他标本。在4种白血病细胞系中,Kgla中NP-β-catenin水平高于另外3个细胞系。　　 2、采用RT-PCR检测mdr1mRNA在12例白血病患者标本,6例正常标本及4种白血病细胞系中的表达情况。结果显示所有6例正常标本均未检出mdr1mRNA表达。而在白血病患者标本中,存在NP-β-catenin高水平表达的3例患者(L2、L7、L8)中检出mdrlmRNA表达。在4种细胞系中,Kgla存在mdrlmRNA表达。　　 3、采用Westernblot检测P-gp在12例白血病患者标本,6例正常标本及4种白血病细胞系中的表达情况。检测结果与mdr1mRNA一致,即只在NP-β-catenin高水平表达的3例患者(L2、L7、L8)中检出P-gp表达。在4种细胞系中,KG1a检出P-gp表达。　　 4、使用去甲基化试剂DAC处理P-gp阳性标本L2、L7、L8和KGla,恢复SFRP5表达。使用real-timePCR检测mdrlmRNA表达。结果显示经去甲基化试剂处理后,L2、L7、L8和KGla中mdr1mRNA水平均显著下降(P＜0.01)。进一步采用Westernblot检测L2、L7、L8和KGla中P-gp水平,结果显示P-gp表达水平在SFRP5表达恢复后亦被下调。　　 三、恢复SFRP5表达以逆转白血病KGla细胞多药耐药性的研究　　 1、成功构建表达SFRP5的KG1a/SFRP5细胞,及表达eGFP的KG1a/eGFP细胞。　　 2、采用real-timePCR检测mdr1表达,结果显示KG1a/SFRP5细胞中mdr1mRNA水平显著下降(P＜0.01)。　　 3、采用Westernblot检测P-gp水平,结果显示KGla/SFRP5细胞中总P-gp表达水平在SFRP5表达恢复后亦被下调。　　 4、采用免疫荧光显微镜观察细胞膜表面P-gp表达,结果显示KGla/SFRP5细胞膜表面P-gp荧光强度减弱。　　 5、采用流式细胞仪检测细胞内药物浓度,结果显示KGla/SFRP5细胞内的罗丹明浓度显著升高(P＜0.01)。　　 6、采用MTT方法检测细胞耐药性,结果显示KGla/SFRP5细胞对ADR的IC50较KGla细胞显著降低(P＜0.01),细胞耐药性下降。　　 结论：　　 1、白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致SFRP5蛋白表达缺失或下调。　　 2、SFRP5蛋白表达缺失可导致Wnt/β-catenin信号通路被激活,活化的β-catenin激活下游靶基因mdrl转录,编码的药物外排泵P-gp表达增加,促进白血病多药耐药的形成。　　 3、恢复SFRP5蛋白表达可以下调mdr1转录及P-gp表达,增加细胞内药物浓度,逆转多药耐药。