研究背景:器官移植仍然是器官功能衰竭最有效的治疗方法,为了提高移植器官的存活时间,新的技术及免疫抑制剂的开发是主要的研究方向。然而,即使免疫抑制剂已经广泛应用,急性排斥反应（acute rejection,AR）仍是影响接受器官移植患者存活的主要障碍之一。而且,器官移植后长期使用免疫抑制剂通常会引起全身性的副作用,严重影响受者的长期存活与生活质量。寻求替代的抗排斥疗法来减少,甚至避免使用免疫抑制剂是一直以来的研究热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有低抗原性,可塑性强,向炎症部位聚集等特点,目前已经成为器官移植免疫排斥细胞治疗的重要候选者之一。但是MSCs抑制免疫排斥的能力有限,并且MSCs具有多个细胞亚型,难以确定哪种亚型在免疫排斥过程中发挥关键作用。由于MSCs具有较强的可塑性,通过转染的方法增强MSCs的功能是可行的方法之一。可溶性纤维蛋白原样蛋白2（soluble fibrinogen-like protein 2,sFgl2）,是一种主要由CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞和耐受性CD8⁺CD45 RC ^low Treg细胞分泌的免疫抑制因子。SFgl2主要通过与巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞表面FcγⅡB受体（FcγⅡB receptor,FcγⅡBR）结合发挥免疫调节作用。Sfgl2在出现耐受的小鼠心脏移植和肝脏移植模型中表达增高,并可以通过诱导M2型巨噬细胞分化抑制大鼠急性肝移植排斥反应。在肿瘤微环境中,sFgl2增高会促进肿瘤相关巨噬细胞分化并促进肿瘤进展。这些研究提示sFgl2可能通过调节巨噬细胞功能抑制排斥反应。研究目的:本研究的目的是寻找可以增强MSCs免疫抑制功能的方法,减少细胞治疗中MSCs的使用剂量。通过转染的方式使MSCs过表达sFgl2,进一步探究sFgl2-MSCs对巨噬细胞分化的影响及抑制小鼠心脏移植急性排斥反应的能力。研究方法:本研究共分为三个部分。第一部分,分离培养小鼠脂肪来源的MSCs,通过流式细胞术鉴定表型。克隆FGL2基因片段,将目的基因片段插入真核表达质粒中,获取含有目的基因的真核表达质粒,并构建慢病毒载体系统。转染MSCs并通过药物筛选获取稳定过表达sFgl2的MSCs。通过划痕实验,细胞增殖检测（cell counting kit-8,CCK-8）及流式细胞术分析,证实转染不会影响MSCs迁移能力,增殖能力及表型。通过体外炎症环境刺激,证实在炎症环境下sFgl2-MSCs过表达sFgl2的能力不受影响。在第二部分,通过将野生型MSCs（wild type MSCs,WT-MSCs）,阴性对照病毒（包含空载质粒）转染的MSCs（negative control MSCs,MSCs-NC）,sFgl2-MSCs或CsA与体外诱导的小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行共培养,探究sFgl2-MSCs对巨噬细胞凋亡、功能及分化的影响,并探讨其发挥作用的机制。共培养条件为,将MSCs接种于transwell上室（0.4μm孔径）,初始巨噬细胞（M0）接种于tranwell下室进行共培养或接种初始巨噬细胞同时添加LPS+IFN-γ（M0+LPS+IFN-γ）进行共培养。通过transwell实验（8μm孔径）,检测共培养处理后的巨噬细胞迁移能力的变化。通过流式细胞术检测共培养处理后巨噬细胞凋亡比例及分化情况,western blot及qRT-PCR探究sFgl2-MSCs诱导巨噬细胞分化的可能机制。通过混合淋巴细胞反应,检测共培养处理后巨噬细胞对T细胞分化的影响。并检测巨噬细胞对微血管内皮细胞（microvascular endothelial cell,MVEC）凋亡的影响及高迁移率族蛋白B1（high-mobility group protein 1,HMGB1）表达影响。在第三部分,在小鼠心脏移植模型中,探究了sFgl2-MSCs对小鼠心脏移植急性排斥反应的抑制作用及对小鼠体内巨噬细胞分化的影响。首先通过显微外科技术建立了小鼠腹腔异位心脏移植模型,通过小鼠尾静脉或阴茎背静脉给予小鼠生理盐水,CsA或MSCs治疗。统计各组小鼠心脏移植物存活时间,苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）确认各组小鼠心脏移植物急性排斥反应情况,免疫组织化学染色确认各组小鼠心脏移植物中巨噬细胞浸润情况。流式细胞术分析受体小鼠脾脏细胞中巨噬细胞分化情况及比例,确认sFgl2-MSCs在小鼠体内对巨噬细胞分化的影响。研究结果:1.第一部分,成功分选并培养小鼠脂肪来源的MSCs,表型鉴定显示细胞高表达CD44,CD105,CD29及CD90,基本不表达CD45及CD34。成功构建了含有sFgl2基因的慢病毒载体,通过转染预实验,选择感染复数（multiplicity of infection,MOI）为200进行正式感染实验。转染后的MSCs通过嘌呤霉素筛选,可以获得在体外培养条件下稳定过表达sFgl2的MSCs。转染不会改变MSCs的增殖、迁移能力及表型。并且,在非炎症和体外模拟炎症培养环境下,sFgl2-MSCs可以稳定分泌sFgl2（745.59±13.31ng/mL vs 754.00±10.31 ng/mL）。2.第二部分,在急性排斥反应过程中,受体小鼠脾脏及心脏移植物中M1型巨噬细胞比例增加（P<0.05）,M2型巨噬细胞细胞比例降低（P<0.05）,促进巨噬细胞活化的因子HMGB1表达增加。这个结果提示巨噬细胞是参与急性排斥反应的重要细胞。进一步的研究探究了sFgl2-MSCs在体外对巨噬细胞凋亡、功能及分化的影响。流式分析结果显示在共培养条件下,各组巨噬细胞凋亡比例无差异（P>0.05）。吞噬实验结果显示,与M0共培养时,sFgl2-MSCs,WT-MSCs及MSCs-NC组FITC阳性细胞比例较对照组及CsA组增加（P<0.05）,但三组之间FITC阳性细胞比例无差异（P>0.05）;加入LPS+IFN-γ刺激时,对照组、CsA组WT-MSCs及MSCs-NC组FITC阳性细胞比例降低（P<0.05）,sFgl2-MSCs组阳性细胞比例增高（M0:46.93±1.02 vs M0+LPS+IFN-γ:58.53±2.50%）（P<0.05）。CsA不影响巨噬细胞迁移能力及分化。对于M0,sFgl2-MSCs,WT-MSCs及MSCs-NC组迁移能力及M2型巨噬细胞比例无差异（P>0.05）;加入LPS+IFN-γ刺激时,sFgl2-MSCs组巨噬细胞迁移能力增强并且高于其他处理组（P<0.05）,CD68⁺CD206⁺M2型巨噬细胞比例增高（M0:11.04±1.15%vs M0+LPS+IFN-γ:69.57±3.91%）（P<0.05）,并且明显高于其他处理组（P<0.05）。这提示sFgl2-MSCs发挥功能的节点可能在巨噬细胞活化、分化的过程中,而不是对M0发挥作用。与M0+LPS+IFN-γ共培养后,western blot检测sFgl2-MSCs组巨噬细胞中STAT1及P65表达及磷酸化均受到抑制,IκB表达增加但磷酸化受抑制,同时STAT3的表达及磷酸化明显增加。混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）结果显示,sFgl2-MSCs处理后巨噬细胞明显抑制Th1分化,促进Treg分化及活化。并且,sFgl2-MSCs处理后巨噬细胞促进MVEC凋亡能力减弱。3.第三部分,生存期分析结果显示,对照组心脏移植物存活时间为8.33±0.52天,CsA治疗组小鼠心脏移植物平均生存时间为58.83±7.67天,WT-MSCs及MSCs-NC组心脏移植物存活时间分别为15.3±1.03天,15.7±0.82天。SFgl2-MSCs治疗组小鼠心脏移植物生存时间为52.0±10.67天,较对照组及WT-MSCs及MSCs-NC组明显延长（P<0.05）。HE染色显示14天时,sFgl2-MSCs组急性排斥反应明显受抑制。在CsA及sFgl2-MSCs治疗组中,部分小鼠生存期可超过60天。在小鼠心脏移植模型中,sFgl2-MSCs诱导小鼠体内M2型巨噬细胞分化,小鼠脾脏Treg及TIGIT⁺Treg比例均增加,促进多种炎症抑制因子如IL-4,IL-10,TGF-β1的表达,抑制TNF-α,IL-6及IFN-γ的表达。与CsA广泛抑制T细胞功能的作用不同,通过抑制M1型巨噬细胞分化,促进M2型巨噬细胞分化可能是sFgl2-MSCs抑制急性排斥反应的机制。研究结论:经慢病毒转染系统可以获得稳定过表达sFgl2的MSCs细胞。SFgl2-MSCs可以通过JAK-STAT及NF-κB通路调节M2型巨噬细胞分化,并抑制M1型巨噬细胞细胞分化。在小鼠心脏移植急性排斥反应模型中,sFgl2-MSCs抑制急性排斥反应的能力优于WT-MSCs。并可以通过诱导炎症抑制因子如IL-10,IL-4,TGF-β1等表达,同时抑制炎症因子的表达。通过调控巨噬细胞功能可能是sFgl2-MSCs抑制小鼠心脏移植急性排斥反应的作用机制之一。