一、研究背景: 系统性红斑狼疮(SLE)是一个累及多个系统的自身免疫性结缔组织疾病。临床表现多种多样，致残致死率高。目前主要依赖药物治疗，缺乏副作用小、长期有效的治疗手段。因此非常有必要进一步探索疾病发生机理和寻求新的治疗方法。 骨髓间充质干细胞(BM—MSCs)是骨髓来源的不同于造血干细胞的另一种多能干细胞。该细胞具有多分化潜能，可以分化为多个胚层的细胞；具有低免疫原性，不会刺激同种异体淋巴细胞增殖；具有强的免疫调节作用，可以抑制多种免疫细胞的增殖和活化，包括T、B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞。MSCs主要通过可溶性的细胞因子发挥免疫调节作用，转化生长因子β1(TGF—β1)是其中一个非常重要的因子。 BM—MSCs在移植耐受、胎儿胎盘免疫耐受、自身免疫中有非常重要的免疫调节作用和现实意义。体外实验、动物实验和人体实验显示，MSCs可以抑制SLE异常的免疫反应，改善疾病症状，安全性高，副作用小。同种异体BM—MSCs移植治疗SLE患者具备理论基础和得到实践检验。但是，BM—MSCs移植治疗SLE患者的时机和细胞输入量仍未确定。BM—MSCs的免疫调节作用是剂量依赖的且具有双向性，正确的输入量非常重要。SLE患者体内存在许多异常因素如细胞因子异常和免疫细胞紊乱。这些异常因素是否影响MSCs的存活和免疫功能的发挥，未见相关文献报道。因此，非常有必要进一步研究机体内环境(主要是外周血)对MSCs增殖和免疫调节功能的影响，为确定输入MSCs的最佳时机和调整输入MSCs的数量提供参考依据。 二、研究目的: 本次试验拟通过研究处于不同疾病状态(稳定期、活动期)的SLE患者的血清对正常人骨髓MSCs增殖的影响，以及处于不同疾病状态(稳定期、活动期)的SLE患者外周血单个核细胞对正常人BM—MSCs增殖和分泌TGF—β1的影响，为选择什么时机输入MSCs，应该输入多少MSCs提供初步的理论依据。 三、研究方法: 1、Ficoll梯度密度离心法联合羟乙基淀粉自然沉淀法分离健康志愿者骨髓间充质干细胞。体外培养、扩增。流式细胞仪鉴定细胞表面分子CD29、CD44、CD34、CD45、CD105、HLA—DR。流式细胞仪检测细胞凋亡。CCK—8法绘制骨髓MSCs生长曲线。 2、制备含不同浓度(5％、10％、15％、20％)健康志愿者、SLE患者活动期、稳定期血清的低糖DMEM(LG—DMEM)培养基。培养MSCs三天后CCK—8法检测各组MSCs的增殖情况。ELISA检测各组血清中TGF—β1的水平。 3、分离健康志愿者、活动期SLE患者、稳定期SLE患者PBMC，按不同比例(PBMC/MSC0.1：1、1：1、10：1、100：1、500：1)与健康志愿者骨髓MSCs混合培养。三天后CCK—8法分别检测各组PBMC和MSCs的增殖情况。ELISA检测培养上清TGF—β1的水平。 4、统计方法：试验结果以均数士标准差(X±s)表示。利用SAS8.1统计软件包分析实验数据。同组内各浓度(比例)间差异采用随机区组设计资料的方差分析，同一浓度(比例)不同组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用多组均数问的多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。 四、结果: 1、利用Ficoll梯度密度离心法联合羟乙基淀粉自然沉淀法成功分离健康志愿者骨髓MSCs。流式细胞仪鉴定表面分子显示，MSCs高表达CD29、CD44、CD105，低表达或不表达CD34、CD45、HLA—DR，第3代BM—MSCs纯度达到了99％。凋亡细胞率为2.03％。细胞生长状况良好。 2、健康对照组各血清浓度(5％、10％、15％、20％)培养BM—MSCs三天后吸光度值分别为0.194±0.017、0.238±0.035、0.289±0.015、0.407±0.022；SLE稳定期组分别为0.16±0.015、0.196±0.012、0.199±0.023、0.310±0.016；SLE活动期组分别为0.111±0.016、0.138±0.014、0.199±0.022、0.199±0.023。健康对照组内各血清浓度间吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)，SLE患者稳定期组内各血清浓度间吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)，活动期组内各血清浓度间吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。SLE稳定期组、活动期组的各血清浓度组与健康对照组相应血清浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 3、健康对照组、SLE活动期患者和稳定期患者PBMC与同种异体BM—MSCs细胞按不同比例(PBMC/MSC：500：1、100：1、10：1、1：1、0.1：1)混合培养，结果显示，当PBMC/MSC比值较高时(500：1、100：1) BM—MSCs增殖受到抑制(与空白对照组比较差异具有统计学意义P<0.05)，SLE活动期和稳定期PBMC抑制BM—MSCs增殖(与健康对照组比较差异有统计学意义P<0.05)。三组内部不同比例间相互比较显示，随着PBMC/MSC比值的增加，BM—MSCs增殖受到的抑制增强(不同比例组间比较差异具有统计学意义P<0.05)。 4、健康对照组、SLE活动期患者和稳定期患者PBMC与健康志愿者BM—MSCs细胞按不同比例(PBMC/MSC：500：1、100：1、10：1、1：1、0.1：1)混合培养，结果显示，当PBMC/ MSC比值较低时(0.1：1、1：1、10：1)，各组PBMC的增殖率低于空白对照组(P<0.05)。随着PBMC/ MSC比值逐渐增大，健康对照组、SLE活动期患者和稳定期患者PBMC的存活率逐渐增大(组内各个比例间差异具有统计学意义P<0.05)，抑制率逐渐降低(组内各个比例间差异具有统计学意义P<0.05)。当PBMC/ MSC比值为10：1和100：1时，SLE活动期和稳定期患者PBMC存活率高于健康对照组(P<0.05)，抑制率低于健康对照组(P<0.05)。 5、ELISA检测各组血清中TGF—β1的含量，结果显示健康对照组406.79±48.3(pg/ml)，SLE稳定期患者血清375.22±52.6(pg/ml)，SLE活动期患者血清335.12±60.37(pg/ml)。三组间TGF—β1水平差异具有统计学意义，健康对照组高于SLE患者，SLE稳定期血清TGF—β1高于活动期(P<0.05)。 6、PBMC/MSC比例为0.1：1、1：1、10：1时，BM—MSCs分泌TGF—β1水平高于空白对照组水平，比例为100：1、500：1时低于空白对照(各组与空白对照组比较差异具有统计学意义，P<0.05)。 五、结论: 1、SLE患者血清抑制骨髓MSCs增殖，可能与血清TGF—β1水平降低有关。 2、外周血单个核细胞与骨髓MSCs存在相互抑制，抑制的方向取决于两者的比例。当PBMC/MSC比值≤10：1时，健康志愿者BM—MSCs抑制SLE患者PBMC增殖，随着PBMC/MSC比值增大抑制减弱，且与SLE患者的疾病活动程度相关。当PBMC/MSC比值≥100：1，SLE患者PBMC抑制健康志愿者BM—MSCs增殖，随着PBMC/MSC比值增大抑制增强，且与SLE患者的疾病活动程度相关。 3、SLE患者PBMC可以影响BM—MSCs分泌TGF—β1。当PBMC/MSC比值≤10：1时，PBMC刺激MSCs分泌TGF—β1，当比值≥100：1时则抑制分泌。