[研究背景]乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤之首,而获得性多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是导致其化疗失败得重要因素之一,为乳腺癌的治疗带来巨大障碍。在药物诱导后,肿瘤细胞对结构和功能不相关的药物耐药,即为多药耐药现象。在人类耐药肿瘤细胞中,MDR机制主要涉及三种表型的转运蛋白：P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance protein, MRP1-7)和乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP/ABCG2)。这些蛋白均属于ATP结合盒(Adenosine triphosphate-binding cassette, ABC)膜转运蛋白超家族,作为药物排出泵,可以导致胞内的细胞毒药物浓度降低,使肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药。BCRP/ABCG2是ABC转运蛋白超家族成员之一,在多药耐药方面起着不可忽视的作用。因最先在乳腺癌耐药细胞系MCF-7/AdrVp中被发现而得名。它可以在多种正常组织、细胞系和肿瘤组织中表达。过表达BCRP可以导致肿瘤细胞系对多种化疗药物耐药,米托葸醌、拓扑替康、阿霉素等均为其底物。人的BCRP基因,由ABCG2基因编码,定位于染色体4q22,含有16个外显子和15个内含子,基因跨度为66kb,编码分子量为72kD的跨膜蛋白；BCRP基因转录起始位点上游312bp的序列,是该基因启动子的基本活性区域。BCRP蛋白在结构上相当于P-gp的一半,又被称为不完全转运蛋白。BCRP蛋白在内质网内合成,经高尔基体转运至细胞膜而发挥作用。以往在实体肿瘤中,对BCRP表达的判定多以胞浆阳性为主,但这可能并不能反映出该蛋白的功能状态。乳腺癌是一种激素依赖性的全身性疾病,其生长受雌激素、孕激素和雄激素等类固醇激素调节。雌激素及雌激素受体(Estrogen receptor, ER)在乳腺癌的发生发展中的作用已得到深入的研究和广泛的认同。以往一直认为孕激素受体(Progesterone receptor，PR)仅仅是ER具有功能活性的一个标志。但与此相悖的是,临床上大概有5%左右的乳腺癌是ER-/PR+,并且这类ER-/PR+的肿瘤比ER+/PR+、ER+/PR-、ER-/PR-的对激素反应性差、侵袭力强,预后更差。这提示我们,PR可能不仅仅是ER具有功能活性一个标记,它或许具有某些非ER依赖性的功能。本课题组曾报道17β-雌二醇与ER结合后,可以结合至雌激素反应元件(Estrogen response element, ERE)进而增强BCRP的转录活性；而其拮抗剂三苯氧胺、托瑞米芬则可以降低BCRP的表达,逆转由BCRP介导的MDR。在对绒毛膜细胞癌的研究中发现,BCRP启动子5’端侧翼序列上游的-243到-115bp之间的ERE同时也是一个孕激素反应元件(progesterone response element, PRE),但目前尚无实验报道,PRE是否具有调节乳腺癌中BCRP介导的MDR的功能。本研究中,我们首先应用免疫组织化学的方法,检测了95例乳腺癌组织中BCRP、ERα、PR及人表皮生长因子受体-2(Her-2)的表达；进而,构建含有PRE的启动子序列,将其连接到已含有BCRP cDNA的载体上,构建出含有PRE的BCRP启动子和BCRP cDNA的载体pEGFP-C1/P-BCRP,同时以含有CMV启动子和]BCRP cDNA的载体pEGFP-C1/C-BCRP作对照,分别转染PR+的细胞株T47D、MCF-7和PR-细胞株MDA-MB-231,加入不同浓度的孕酮(progesterone, PROG)及其拮抗剂米非司酮(Mifepristone, MFP/RU-486),检测BCRP在mRNA水平、蛋白水平及功能上的改变,并阐述孕激素调节乳腺癌耐药相关蛋白表达的可能机制。[实验方法]1.免疫组化：采用免疫组织化学二步法(PV-9000法)检测95例原发性乳腺浸润性导管癌组织中BCRP、ERα、PR和Her-2的表达情况,并分析了BCRP的表达与后三者之间的相关性,以及与乳腺癌临床病理特征之间的关系。2.质粒构建：1)重组质粒的构建：应用Apa I和BamH I双酶切pcDNA3.1/BCRP cDNA(本实验室保存),并将其连接至含有绿色荧光蛋白和筛选标记的质粒pEGFP-C1的多克隆位点,命名为pEGFP-C1/C-BCRP;2)人工合成含有PRE的BCRP核心启动子区,并连接至pEGFP-C1/BCRP载体中,命名为pEGFP-C1/P-BCRP,经TaKaRa公司测序结果证实正确后,大量扩增。3.细胞系的检测：应用Western Blotting法检测本实验室培养的细胞系MCF-7、T47D、 MDA-MB-231中PR表达。4.细胞培养及转染：将重组质粒pEGFP-C1/P-BCRP、pEGFP-C1/C-BCRP分别瞬时转染PR(+)MCF-7和PR(-)的MDA-MB-231细胞系；稳定转染PR(+)的T47D细胞系。对瞬时转染组,48hrs后收集细胞沉淀；对稳定转染组,G418筛选出稳定表达BCRP的T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP细胞系后,收集细胞沉淀。应用Western Blotting检测BCRP蛋白的表达,鉴定耐药细胞系。5.检测PROG对BCRP表达及功能的调节作用：各组细胞分别加入不同浓度的PROG或RU-486,根据不同的实验,继续培养24hrs、48hrs或72hrs,抽提耐药细胞总RNA、总蛋白,应用RT-PCR或qPCR检测BCRP mRNA水平的变化；Western blotting检测BCRP蛋白表达的变化；流式细胞术检测耐药细胞对米托葸醌外排功能的变化；MTT法检测细胞耐药指数的变化。6.应用凝胶阻滞实验(EMSA):观察细胞核蛋白中的PR与BCRP启动子区PRE之间的相互作用,以探讨PR在调节BCRP介导的MDR中的作用机制。[实验结果]1.免疫组化：95例乳腺癌中,29例BCRP呈膜阳性(30.53%),45例PR呈核阳性(47.37%),65例ERa呈核阳性表达(68.42%)；统计学分析表明,BCRP与ERα、PR蛋白表达均呈负相关(P=0.017、P=0.045)、与是否有淋巴结的转移呈正相关；与Her-2的表达、患者的年龄、肿瘤的大小无关。2.乳腺癌细胞系MCF-7、T47D均为PR(+),而MDA-MB-231为PR(-)。3.重组质粒pEGFP-C1/P-BCRP、pEGFP-C1/C-BCRP转染后,建立的耐药细胞系MCF-7/P-BCRP、MCF-7/C-BCRP、T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP、MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP, Western Blotting检测表明BCRP蛋白的表达明显增加。4.PROG处理后(1)瞬时转染组：瞬时转染24hrs后,MCF-7/P-BCRP、MCF-7/C-BCRP、MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP各组细胞分别加入不同浓度的PROG (0、10-13、10-11、10-9、10-7、10-5M)。PROG作用24hrs后,MCF-7/P-BCRP组与对照组比较,BCRP mRNA水平分别降低了12.5%,19.8%,32.43%,42.6%和50.1%(P<0.01)；而在MCF-7/C-BCRP组,各处理组间BCRP mRNA表达无明显差异(P>0.05)。同样,在MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP组,各处理组间BCRP mRNA表达亦无明显差异(P>0.05)。PROG作用48hrs后,MCF-7/P-BCRP组与对照组比较,BCRP蛋白表达水平分别降低了33.3%,50.0%,59.5%,66.7%and80.9%(P<0.01),而MCF-7/C-BCRP组,各处理组间BCRP表达无明显差异(P>0.05)并且,在MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP组,BCRP蛋白的表达在各组间亦无明显差异(P>0.05)。(2)稳定转染组：建立两种耐药细胞系T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP后,各组细胞分别加入不同浓度的PROG (0,10-13、10-11、10-9、10-5M)。在T47D/P-BCRP组,PROG以浓度依赖方式抑制BCRP mRNA的表达；并且这种抑制作用可被10倍于PROG(10-5M)浓度的RU-486(104M)所拮抗(P<0.01)。而在T47D/C-BCRP组,PROG或PROG联合RU-486处理后,均未见BCRP mRNA有明显变化(P>0.05)。在T47D/P-BCRP细胞株,PROG可以浓度依赖方式抑制BCRP蛋白的表达(P<0.01),并且这种作用可以被RU-486所拮抗；T47D/C-BCRP,10-11M和10-9M组PROG刺激BCRP蛋白的表达,但这种作用不能被RU-486所阻断。(3)米托葸醌外排实验表明：PROG (10-5M)处理后,与对照组比较,T47D/P-BCRP细胞由于BCRP蛋白表达降低,荧光峰值右移,且该现象可以被RU-486(10-4M)所拮抗；在T47D/C-BCRP组,PROG (10-5M)处理后,荧光峰值左移,且该效应不能被RU-486所拮抗。(4)MTT检测各组细胞对米托蒽醌的耐受性,结果显示,T47D,T47D/P-BCRP+PROG, T47D/P-BCRP, T47D/C-BCRP+PROG和T47D/C-BCRP各组细胞组中,ICso分别为0.06±0.02μmol/L,0.26±0.03μmol/L,.36±0.36μmol/L,1.25±0.26μmol/L和1.40±0.17μmol/L。T47D/C-BCRP组与T47D组比较,其对化疗药的敏感性增加了24.40倍(P<0.01)；PROG处理后,其耐药性增加了22.61倍(P<0.01)。而在T47D/P-BCRP组,与T47D组比较,其细胞对化疗药的耐受性增加了25.08倍(P<0.01)；PROG处理后,其细胞对化疗药的耐受性降低至对照组的4.63倍,差异无显著性(P>0.05)5.EMSA实验结果显示：细胞核蛋白与含有保守性PRE序列的寡核苷酸探针和抗PR抗体共同孵育后,在PR(+)的MCF-7细胞株可检测到特异性结合复合物,而在PR(-)的MDA-MB-231则未见到这种特异性结合。[结论]1.本实验结合BCRP的功能特点,对免疫组化结果进行评分,结果显示BCRP与ERα、PR的表达负相关；与是否有淋巴结的转移呈正相关；与Her-2的表达、患者的年龄、肿瘤的大小无关。2.PROG在细胞的水平,可明显抑制PR阳性乳腺癌细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达,提示孕激素可能具有与雌激素受体拮抗剂相似的作用、即可逆转BCRP介导的多药耐药。3.PROG发挥其抑制功能,可能是通过PROG与PR复合物,进入核内与BCRP基因启动子区的PRE结合,抑制BCRP基因启动子而减弱BCRP的转录活性,从而下调细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达,来发挥其调控基因的作用。