研究背景:肿瘤细胞能够通过多种途径逃避机体免疫系统的清除,PD-1/PD-L1免疫检查点在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。肿瘤细胞通过调控PD-1配体(PD-L1)过表达,识别肿瘤浸润性效应T细胞表达的PD-1蛋白,激活PD-1/PD-L1信号通路,传递免疫抑制性信号,降低效应T细胞的活性及肿瘤杀伤性细胞因子分泌水平,最终导致肿瘤细胞逃避免疫清除。因此,通过阻断PD-1/PD-L1免疫检查点而逆转肿瘤免疫耐受已成为抗肿瘤免疫治疗的新方向。以PD-1/PD-L1免疫检查点为靶点的单克隆抗体药物在多种恶性肿瘤的免疫治疗中已显示出惊人作用,但将其应用于肝癌患者免疫治疗的报道却较少。肝癌是一种高病死率的恶性肿瘤,严重威胁着人类健康,而我国每年因肝癌而死亡的患者数占全世界肝癌死亡患者数的一半左右,故PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肝癌的免疫治疗中具有广泛的应用前景。目前,PD-1表达水平能否作为肝癌免疫治疗及预后评估的生物标志物尚不清楚,阻断PD-1/PD-L1免疫检查点的单克隆抗体药物能否在肝癌治疗中取得良好效果也有待进一步研究,因此,深入研究抗PD-1单克隆抗体在肝癌免疫治疗中的效应和作用机制对肝癌免疫治疗药物开发及肝癌患者的诊断治疗均具有重要意义。目前,多种抗PD-1/PD-L1单克隆抗体药物已进入临床试验阶段,并取得良好的疗效。但肿瘤患者应答率低,疗效限制在小部分患者中,并且常伴随着直接或间接的毒副反应,抗PD-1/PD-L1抗体药物免疫治疗的毒副反应可在一定程度上抵消抗体制剂的功效或影响其临床应用。因此,继续研发毒副作用低、可应用于肝癌免疫治疗的抗PD-1/PD-L1单克隆抗体,及如何应用抗体制剂以最大化发挥其在肿瘤免疫治疗中的作用,是一项非常有现实意义的研究课题。研究目的:本课题拟制备筛选并获得新的高特异性和高阻断活性的小鼠抗人PD-1单克隆抗体,采用高特异性抗体研究PD-1在肝细胞癌(HCC)组织表达的临床意义,并对高阻断活性抗体逆转Jurkat细胞免疫抑制的作用及作用机制进行了初步探讨。方法:1.小鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及鉴定以重组人源PD-1蛋白作为免疫蛋白,采用经典的BALB/c小鼠免疫法制备小鼠抗人PD-1单克隆抗体,鉴定单抗的Ig G类别及亚类、抗原识别特异性和细胞毒性等生物学特性。2.以自研PD-1单抗探讨HCC组织上PD-1表达的临床意义利用制备获得的高特异性PD-1单抗对肝细胞癌患者肿瘤组织行HE染色和免疫组织化学检测,统计分析PD-1在肝细胞癌患者肿瘤组织上的表达水平与患者临床病理特征的相关性,进而评价PD-1单抗应用于肝癌治疗的可能性。3.PD-1单抗逆转Jurkat细胞免疫抑制的作用研究建立HepG2细胞和Jurkat细胞共同培养体系,筛选出具有最佳生物阻断活性的小鼠抗人PD-1单克隆抗体。ELISA法检测筛选获得的PD-1单抗对Jurkat细胞分泌抗肿瘤细胞因子的影响;MTT法分析此PD-1单抗对Jurkat细胞杀伤HepG2细胞能力的影响,研究PD-1单抗在共培养体系中对Jurkat细胞免疫抑制的逆转作用。4.PD-1单抗逆转Jurkat细胞免疫抑制的机制初探在前期实验的基础上,采用流式细胞技术和Western Blot实验观察Hep G2细胞和Jurkat细胞共培养体系中Jurkat细胞的细胞周期、凋亡状态的改变。并采用生物阻断活性最佳的PD-1单抗孵育阻断共培养体系中PD-1/PD-L1通路,进一步观察Jurkat细胞凋亡水平、凋亡相关蛋白及上下游调控分子表达的变化,从而对PD-1单抗逆转Jurkat细胞免疫抑制的作用机制进行初步的探讨。结果:1.获得了14株小鼠抗人PD-1单克隆抗体,分别命名为1C4、1H8、2C4、2H7、3E5、5B2、5H7、7C9、7E5、7G12、9A5、9B4、9E11和B1C4。2.ELISA和Western Blot结果显示,PD-1单抗2C4、5B2、5H7、7E5、7G12、9A5、9B4、9E11和B1C4可明显识别免疫原PD-1蛋白分子。免疫组织化学结果显示,单抗9E11对肝细胞癌组织上表达的PD-1蛋白结合能力最强,抗原识别特异性最高。3.利用单抗9E11研究PD-1在HCC组织上的表达及其临床意义的结果显示,PD-1+T淋巴细胞主要分布在与肿瘤交界处的的瘤周组织中;PD-1在HCC组织上的表达水平与患者肿瘤大小及分化程度密切相关,与患者有无静脉栓塞相关性较小,与患者性别、年龄、有无肝硬化、有无感染乙型肝炎、TNM分期和肿瘤发生部位等临床病理特征无相关性。4.在14种PD-1单抗中,单抗2H7和B1C4生物阻断活性最强,可显著提高共培养体系中Jurkat细胞的杀肿瘤细胞因子分泌水平,提高Jurkat细胞对Hep G2细胞杀伤能力。但高浓度的单抗2H7和B1C4长时间处理仍对Jurkat细胞有一定毒性作用。5.单抗B1C4可使阻滞于S期的Jurkat细胞减少,增加G2/M期的细胞比例;单抗B1C4还可以抑制共培养体系诱导的Jurkat细胞凋亡,影响共培养体系中Jurkat细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达,使抑制AKT磷酸化的PTEN蛋白表达水平降低,AKT蛋白磷酸化水平提高及下游的促凋亡蛋白Bax表达降低,抗凋亡蛋白mTOR磷酸化水平升高。结论:1.成功制备并获得了14株小鼠抗人PD-1单克隆抗体,根据各自的抗原识别特异性差异,可作为ELISA、Western Blot和IHC等实验中的检测抗体。2.PD-1在HCC组织上的表达水平与患者肿瘤大小及肿瘤分化程度显著性相关,以PD-1为靶点的抗PD-1单克隆抗体药物在低分化HCC患者的诊断和治疗中具有着潜在的应用价值。3.所制备的单抗2H7和B1C4细胞毒性较低,能够逆转Jurkat细胞免疫抑制状态,显著提高Jurkat细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。4.单抗B1C4可通过激活Jurkat细胞PI3K/AKT信号通路来阻断PD-1/PD-L1免疫检查点介导的免疫负调控作用,进而削弱肿瘤细胞源性的PD-L1引起的Jurkat细胞凋亡,逆转HepG2细胞诱导的Jurkat细胞免疫抑制。