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多数病原菌通过损伤消化道、呼吸道局部黏膜组织，突破黏膜免疫屏障，进入血液循环系统，引发人或动物的细菌性疾病。在实际生产中，由于饲料普遍添加抗生素，动物长期采食引发细菌耐药性增强，加之不同细菌引发消化道、呼吸道疾病的临床症状相似等原因，在治疗细菌病的过程中只得加大抗生素的用量，同时联合广谱抗菌药物治疗疾病，使得细菌抗药性的问题进一步恶化。因此，快速、准确鉴别诊断病原以便针对性用药，对于缓解乃至解决细菌耐药性问题至关重要；对于保障养殖业及其下游产业的健康发展，减少社会公共卫生安全维持成本具有重要价值。本研究以奇异变形杆菌ureR基因、沙门氏菌invA基因、产气荚膜梭菌α毒素基因、多杀性巴氏杆菌kmt-1基因、溶血曼氏杆菌lktA-artJ intergenic region、化脓隐秘杆菌plo基因为靶位点，设计特异性引物，建立两套多重PCR检测方法，并对扩增体系(引物浓度、dNTP浓度和Mg2+浓度)及扩增条件（退火时间、退火温度和循环次数）等各因素进行优化。扩增得到的序列经BLAST分析，同源性均在98%以上。针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌的多重PCR方法，最低检出限均在4pg/μL以上，略低于3种细菌的单重PCR检测方法的灵敏度(依次为4×10-1pg/μL、4×10-1pg/μL和4×10-4pg/μL)；针对溶血曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌的多重PCR方法最低检出限均在40pg/μL以上，与针对3种细菌的单重PCR方法灵敏度相当（依次为40pg/μL、4pg/μL和40pg/μL）。用实验室分离的17株细菌验证两套多重PCR的特异性，结果表明建立的多重PCR检测方法特异性良好。应用建立的多重PCR方法，多次扩增阳性样品和阴性样品，结果与预期相符，并且不同时间扩增不同批次的菌株结果均一致，表明建立的多重PCR方法检测结果稳定、重复性较好。应用建立的两套多重PCR方法检测人工感染小鼠的病变组织和人工模拟混合感染的临床样品，结果证实建立的检测方法可用于对模拟临床样本的检测。对模拟临床样本进行多重PCR检测，同时分离细菌，两种检测方法结果符合率达100%。本研究建立了针对奇异变形杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌以及多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌的两套三重PCR检测方法，为相应细菌感染引发疾病的诊断和鉴别检测提供了特异、敏感、高通量的实验室诊断方法，为畜禽养殖及畜产品安全生产体系提供一种有效的疫病监控手段。