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疯草是广泛分布于我国西北、美国、俄罗斯、澳大利亚和加拿大草原上的豆科棘豆属和黄芪属有毒植物,苦马豆素（Swainsonine,SW）是其主要毒性成分。然而,SW还具有显著的抗肿瘤作用,通过改变肿瘤细胞表面糖基化作用直接抑制肿瘤细胞,还可以促进细胞因子或化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,因此受到医学界广泛关注。根据现有研究可知,豆类丝核菌（Slafractonia leguminicola）和金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）在体外发酵培养条件下可以产生SW,近年来,有研究人员从疯草中分离到内生真菌—棘豆蠕孢菌（Undifilum oxytropis）,且该菌在SW合成过程中起着主导作用,是疯草类植物中SW的主要来源,但目前有关棘豆蠕孢菌的SW生物合成通路及调控关键酶尚不清楚。鉴于此,课题组前期对棘豆蠕孢菌进行了全基因组测序,筛选并获得了一些可能参与调控SW生物合成的关键酶,哌可酸氧化酶（Pipecolate oxidase,PIPOX）即为其中之一,本试验采用CRISPR/Cas 9基因编辑技术对PIPOX基因进行敲除,成功构建棘豆蠕孢菌PIPOX基因突变菌株,试验结果如下:1.将实验室保存的疯草棘豆蠕孢菌菌种进行活化并扩大培养,对其进行潮霉素敏感浓度的筛选,结果显示棘豆蠕孢菌对潮霉素的敏感浓度为1.5μg/mL。2.在不同酶组合以及不同酶解时间下对原生质体制备、再生的最佳条件进行筛选,同时采用二乙酸荧光素FDA染色法测定原生质体的活力。结果表明:棘豆蠕孢菌接种至PDA培养基培养15 d后,转移至PDB培养基振荡培养10 d,菌丝由复合酶（1%蜗牛酶+1%纤维素酶+1%溶壁酶）处理,放置于25℃80 r/min摇床孵育10 h,原生质体制备效果最佳,数量可达108-109个/mL,FDA染色显示原生质体活力旺盛可用于后续转化实验;将原生质体倒入双层再生培养基于25℃培养5 d时,出现白色再生菌落,原生质体再生成功。3.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对棘豆蠕孢菌基因组中PIPOX基因进行敲除,用pFC332和pFC334质粒构建基因敲除载体,然后采用聚乙二醇PEG-Ca2+法将载体转化原生质体并经潮霉素筛选获得转化株,利用特定引物扩增PIPOX基因序列,与原始序列进行比对结果显示有4 bp碱基对缺失,成功构建棘豆蠕孢菌PIPOX基因突变菌株。本研究采用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功获得棘豆蠕孢菌PIPOX基因突变菌株,为后续验证其在SW生物合成中的调控作用及SW的工业化生产奠定基础。