雪旺细胞的分离培养及RGD复合材料促进周围神经修复作用的研究

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雪旺细胞(Schwann cell,SCs)是周围神经系统一种重要的胶质细胞,能形成有髓神经纤维和无髓神经纤维的神经内膜,具有多种生理功能,增生的雪旺细胞能分泌产生多种促进神经再生修复的神经营养因子与细胞粘附分子。随着组织工程的发展,在构建的神经导管支架材料上种植雪旺细胞,移植入体可以促进轴突生长,从而促进神经修复,但如何快速获取大量雪旺细胞是移植的关键。人工合成的神经导管已被广泛证明可以促进神经再生,具有良好细胞亲和性,能长期持续释放神经生长因子的生物材料逐渐成为周围神经组织工程的研究热点。本文探讨出一种可在短时间内分离培养成年大鼠雪旺细胞的方法,并能使其纯度达到90%以上,数量在10~6/ml以上,来满足临床上修复周围神经损伤的需要。本实验通过预变性大鼠坐骨神经7天后,依次应用组织块种植法,快速酶消化法和双差速贴壁,对得到的细胞进行分离纯化,通过镜下胎盼蓝细胞计数和S-100免疫组化染色鉴定,对分离得到的原代雪旺细胞进行数量计算和纯度计算,实验结果显示通过此法得到的雪旺细胞的数量和纯度均能达到组织工程化人工神经的实验要求。利用各种神经导管可成功桥接修复短段周围神经缺损已被许多实验所证明,应用组织工程技术构建神经导管,为修复长段周围神经缺损提供了新的方法和思路。本实验以聚乳酸为基体材料,接枝了RGD多肽,添加了一定比例的β-TCP和神经生长因子(NGF),制备出一种新型的具有良好降解性能和药物释放性能的复合型神经导管。通过对RGD复合导管材料进行体外模拟降解实验,测定降解过程中浸泡液pH值的变化及材料质量损失率,显示PLA降解速度最慢,24周后膜质量损耗率仅为25%左右,PRGD/PLA,PRGD/PLA/TCP和PRGD/PLA/TCP/NGF膜降解速度相当,在24周时膜损耗率已超过50%。PRGD/PLA膜较PRGD/PLA/TCP,PRGD/PLA/TCP/NGF两组材料pH值下降较快,四种材料的浸泡液在24周内PH值基本呈下降趋势,PRGD/PLA/TCP和PRGD/PLA/TCP/NGF两组材料在第2周左右达6.8,呈微酸性。此外,本实验通过动物实验对RGD复合材料进行了体内生物学评价,动物实验采用大鼠坐骨神经缺损模型,分别采用PDLLA导管、PRGD/PLA/TCP复合型导管和PRGD/PLA/TCP/NGF复合型导管进行导管桥接手术,分别于术后3个月、6个月行大体观察、三头肌恢复率、电生理检测,亚甲蓝染色,电镜观察等方法观察神经再生情况。结果显示:NGF能有效促进坐骨神经损伤的修复,RGD复合材料具有良好的促进神经再生修复的作用。
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