绞股蓝三萜皂苷合成途径相关酶基因的克隆研究

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本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术对绞股蓝进行三萜皂苷生物合成途径相关酶基因的克隆分析,成功克隆得到了2个三萜皂苷合成途径相关酶的基因,进而为绞股蓝三萜皂苷次生代谢途径的研究奠定了基础。主要研究结果如下:(1)绞股蓝总RNA提取和纯化。运用改良的CTAB法提取绞股蓝总RNA,获得了纯度高且完整的总RNA,可以直接用于后续RT-PCR和RACE反应。(2)根据Genbank中报道的已知植物SS、SE序列,同源比对设计简并引物,以cDNA为模板,经PCR扩增、克隆获得两个三萜皂苷合成途径功能酶基因的保守序列。扩增所得的绞股蓝SS、SE部分保守序列,长度分别为443bp、535bp。(3)采用RACE技术获得绞股蓝SS基因全长cDNA序列1496bp,开放读码框(ORF)为1254bp,编码417个氨基酸残基,推导的氨基酸序列与大豆(AB007503)、甘草(AM182331)、辣椒(AF124842)、三七(DQ186630)、人参(AB010148)等氨基酸序列一致性分别达84.3%、83.3%、82.2%、82.2%、81.0%。(4)采用RACE技术获得SE基因全长1818bp,开放读码框(ORF)为1578bp,编码525个氨基酸残基酸残基,推导的氨基酸序列与曼陀罗(AY995182)、水稻2(NM001055998)、苜蓿1(AJ430608)、苜蓿2(AJ430609)、人参(AB122078)、三七(DQ386734)等氨基酸序列一致性分别达80.2%、79.2%、78.6%、78.4%、77.3%、76.7%。上述获得的绞股蓝SS及SE序列信息已提交至GenBank,登录号:SS(FJ906799), SE(FJ906798)。本研究首次采用RACE技术对绞股蓝进行三萜皂苷生物合成途径相关酶的克隆研究,为深入了解绞股蓝三萜皂苷生物合成途径及其调控的分子机制,明确三萜皂苷合成途径功能酶的结构特征及其功能,从而在分子水平上实现三萜皂苷生物合成的人工调控,提高其有效成分三萜皂苷的含量,具有重要的意义。
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