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研究背景:原发性恶性骨肿瘤骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）好发于儿童和青少年,其恶性程度高、侵袭性强、转移率高且目前治疗方案并未明显改善患者的五年生存率。因此,探究OS的发病机制并寻找切实有效的治疗方案,迫在眉睫。近年研究发现,骨膜蛋白（periostin,POSTN）在多种恶性肿瘤的间质细胞中呈高表达,在肿瘤微环境的维持方面发挥重要重要。然而,POSTN在OS增殖和转移过程中发挥的作用,目前尚未研究明确。目的:1.检测正常骨组织和骨肉瘤组织中periostin的表达情况。2.探讨periostin在骨肉瘤形成过程的作用及可能作用机制。3.采用生物信息学分析探索骨肉瘤肺转移的关键蛋白。方法:1.选择3株不同人骨肉瘤（osteosarcoma,OS）细胞系MG-63、Saos-2和U2-OS细胞为研究对象,分别提取RNA和蛋白,检测骨膜蛋白（periostin,POSTN）表达丰度,选择人正常骨组织和人骨肉瘤临床样本组织,行病理学HE染色观察骨肉瘤组织的细胞形态,并采用Western blot法和免疫组化法检测POSTN的表达丰度,采用免疫组化法检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）MMP-1、MMP-3 和MM P-13等骨肉瘤转移相关基因在组织内的表达情况;2.以POSTN表达量较高的骨肉瘤细胞系Saos-2为后续研究对象,采用shRNA质粒转染技术构建POSTN敲减的骨肉瘤细胞系,利用荧光显微镜和RT-qPCR法检测转染效率,采用实时无标记动态细胞分析技术（RTCA）检测细胞增殖情况,Western blot法检测增殖相关蛋白PCNA的相对表达量,采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,同时采用Western blot法验证PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达;3.体内实验以裸鼠为研究对象,转染慢病毒包裹质粒pPLK-POSTN-shRNA的Saos-2细胞异种原位移植注射至腔骨髓腔中,观察裸鼠体内骨肉瘤的增殖情况。采用小动物活体成像扫描技术（FMT）观察裸鼠的血管生成情况,采用western blot法检测POSTN、PCNA、PI3K/AKT通路关键蛋白和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor2,VEGFR2/KDR）的蛋白表达丰度,采用免疫组化法检测瘤体组织内血管内皮黏附分子的表达丰度。4.利用GEO数据库纳入GSE37552（包含2个骨肉瘤肺转移样本和2个骨肉瘤无转移样本）和GSE85537（包含3个骨肉瘤肺转移样本和3个骨肉瘤无转移样本）基因芯片数据集,分析原位骨肉瘤以及肺转移数据集并进—步挖掘核心基因和潜在通路机制。分析差异表达基因的GO分析,并对模块进行KEGG途径分析。使用string构建基因的PPI蛋白网络,Degree算法挑选出与周围基因相关性最强的核心基因。最后,利用GEPIA数据库进行核心基因的总生存分析。结果:1.与正常人软骨细胞系c-28相比,3株人骨肉瘤细胞系中POSTN的表达量均明显升高。在人正常骨组织和骨肉瘤组织中进—步qRT-PCR检测,结果显示与正常骨组织相比,人骨肉瘤组织内POSTN表达上升,免疫组化证实POSTN在蛋白水平同样升高。此外,病理学染色结果显示,人骨肉瘤组织中肉瘤转移相关蛋白MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达也明显升高。2.荧光显微镜检测结果显示,细胞目的基因转染效率超90%。经RT-qPCR和Western blot法验证,与Scramble-shRNA组相比,POSTN-shRNA组中POSTN基因表达明显下降。与Scramble-shRNA组相比,POSTN-shRNA组的细胞增殖和侵袭迁移能力减弱,增殖蛋白PCNA表达量下降,细胞通路相关蛋白AKT和PI3K表达明显降低。3.体内原位移植实验显示,POSTN-shRNA可抑制骨肉瘤形成的大小。FMT结果显示,PO STN-shRNA组裸鼠的瘤体内血管生成量明显低于Scramble-shRNA组。与Scramble-shRNA组相比,POSTN-shRNA组小鼠瘤体的POSTN和PCNA的蛋白表达明显降低,AKT蛋白表达降低,KDR的表达也明显降低,组织中内皮细胞黏附分子表达明显减少。4.采用生物信息学分析,比较骨肉瘤肺转移样本与骨肉瘤无转移样本得到26个表达上调且有显著差异的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。GO分析结果显示:在细胞成分层面上,上调DEGs主要是细胞质膜的主要组成部分,其次是细胞外区的组成部分;在分子功能层面上,发挥细胞外机基质结构成分功能的上调DEGs比例最高;在生物过程层面上,参与信号转导和细胞连接生物过程的上调DEGs占比分别为23.8%和22.5%。POSTN位于网络的中心节点位置,骨肉瘤转移过程中的 hub 基因为 POSTN、COL6A1、CALD1、THY1、NATXR1、IGFBP5、TAGLN,其中POSTN基因位列第—。在所有骨肉瘤患者中,POSTN低表达患者的生存时间明显高于POSTN高表达患者的生存时间。与正常组织相比,肉瘤组织的POSTN基因表达明显升高。结论:通过体内和体外的实验探索,本研究表明,POSTN在骨肉瘤组织中呈高表达。POSTN敲减后可通过抑制PI3K/AKT信号通路,抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力,并可抑制骨肉瘤的血管生成。此外,本研究采用生物信息学技术分析骨肉瘤无转移和骨肉瘤肺转移样本的DEGs,发现POSTN可能是骨肉瘤肺转移患者的关键候选基因。本研究不仅可评价POSTN作为恶性肿瘤生物学行为指标的可行性,还为探求骨肉瘤转移相关基因、干预临床诊疗方案提供基础研究理论依据。