登革病毒(dengue virus, DENV)属于病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavi virus),通过伊蚊等虫媒叮咬进入人体。根据血清抗原性的不同分为四个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4),人类感染其中的任何一型,症状轻者表现为无症状感染或发热,重者可出现严重威胁生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(dengue shock Syndrome, DSS)。登革热主要流行于热带和亚热带地区,威胁着全世界2/5人口健康,但随着国际交流日益频繁、气候变暖、城市化进程加速等原因,登革病毒的流行范围也随之扩大。WHO数据表明,2000年后平均每年报道的感染人数达1亿,每50万～100万例DHF/DSS中约有2.2万例患者死亡,主要为儿童。登革病毒已成为全球公共健康的威胁。尽管登革病毒的发现已经超过60年,但迄今为止,尚未研发出安全有效的登革疫苗或特异性治疗药物,主要原因在于对DHF/DSS的发病机制了解不足。DENV初次感染后体内能产生对四型病毒均有中和活性的抗体,但这一交叉保护作用仅能持续几个月,随后交叉反应性抗体的中和活性下调。当二次感染异型登革病毒时,这些交叉反应性或亚中和活性抗体能促进病毒进入靶细胞而获得大量复制,这一现象称为抗体依赖的病毒感染增强效应(antibody-dependent enhancement, ADE),研究表明,ADE是DHF和DSS发生的主要危险因素。登革病毒是一种有包膜的单股正链RNA病毒,呈二十面体结构,病毒体的直径大约为50nm,基因组大小为10.7kb,编码三种结构蛋白(structural protein),分别是衣壳蛋白(capsid, C)、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane, prM/M)和包膜蛋白(envelope, E),以及七种非结构蛋白(nonstructural protein, NS),分别是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中,E蛋白是机能蛋白,它通过自身构象的改变或表面单元的重排,参与病毒与细胞吸附、病毒进入细胞、细胞膜融合以及病毒组装等病毒生命周期的重要过程。E蛋白是暴露于病毒体表面主要成份,因此,宿主针对DENV产生的中和抗体反应也主要针对这一蛋白。该蛋白在空间上形成3个不同的结构域(envelope protein domain, ED),分别EDⅠ, EDⅡ和EDⅢ, EDⅠ位于中央,呈β环状结构,通过构象改变参与病毒进入靶细胞和核衣壳的脱壳；ED Ⅱ位于侧部,含有在黄病毒属中高度保守的融合环,参与细胞膜融合；EDⅢ呈免疫球蛋白样折叠,被普遍认为含有与靶细胞受体结合的位点。三者均可在宿主体内诱发抗体反应,但是研究表明,针对ED Ⅰ的抗体大多数是无中和活性的抗体；识别ED Ⅱ融合肽免疫显性表位的抗体,在黄病毒属成员间存在广泛的交叉反应,但大多无相对应的交叉中和活性；EDⅢ诱导产生的抗体中和活性最强,并且绝大部分为登革病毒特异性抗体。四型登革病毒之间E蛋白氨基酸序列同源性高达72%～80%,EDⅢ不仅存在血清型特异性中和表位,还存在登革病毒亚交叉或交叉反应性中和表位,因此,以EDⅢ作为登革疫苗研制的靶标可能产生同时针对四型登革病毒的中和抗体,具有广谱抗病毒作用。由于目前尚无获得批准的登革疫苗或抗病毒药物,对登革病毒和其他相关虫媒病毒的保护主要还是通过中和抗体介导。动物实验证明,EDⅢ中和抗体不管是被动免疫或是治疗性免疫均能获得很好的保护效果。因此,若能获得具有强中和活性的EDⅢ抗体,在病毒感染早期有效中和体内登革病毒,对控制疾病加重具有重大意义。由此可见,不管是登革病毒EDⅢ蛋白还是EDⅢ中和抗体在抗病毒研究中具有重要地位,它们是E蛋白广谱交叉抗原表位分析、新型登革疫苗和抗病毒药物研究的重要工具。明确中和抗体与病毒的相互作用对登革病毒致病和免疫机制的阐明至关重要。目前所获得的中和抗体的抗病毒特征绝大部分都来源于鼠源性单抗,动物实验和体外实验表明中和活性最强的抗体主要针对EDⅢ抗原表位,对其表位特征亦已清晰阐明,识别位点主要位于EDⅢ的侧脊和A链区。尽管有研究发现登革热患者血清EDⅢ抗体与中和活性存在关联性,但近年来一些研究也发现EDⅢ抗体仅占抗病毒免疫血清中很小一部分,绝大部分为交叉反应性抗体,去除血清中EDⅢ抗体成份并未对血清的中和活性产生影响,推断中和抗体识别表位可能位于EDⅢ以外部分。因此,EDⅢ抗体在天然抗病毒免疫中作用存在争议,明确登革病毒患者血清中和抗体反应的特点以及EDⅢ抗体对中和活性的作用,对于抗病毒的研究意义重大,也需要更多的临床数据支撑。本研究分为以下两个部分内容：第一部分：登革病毒包膜E蛋白Ⅲ区单抗的体内外中和作用及其作用机制的初步研究登革病毒包膜E蛋白是病毒主要的结构蛋白,该蛋白在空间上形成3个不同的结构域(EDⅠ, EDⅡ和EDⅢ)。研究认为EDⅢ是参与病毒与宿主细胞吸附的区域,同时EDⅢ诱发的特异抗体的体内外中和活性最强。因此,EDⅢ在登革病毒致病机制和抗病毒研究方面意义重大,已成为登革DNA或蛋白疫苗研制的重要靶标。本研究中,我们设想构建对四型登革病毒具有广谱中和活性的EDⅢ反应单抗。在本实验室前期研究中,以重组DENV1～4EDⅢ单独或混合免疫小鼠制备了一批EDⅢ反应性单抗,通过间接酶联免疫吸咐实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫荧光实验(Immuno-fluorescence assay, IFA)测定它们对四型登革病毒的反应特性,发现一株单抗能同时与四型病毒相结合,表明它是一株登革病毒群叉反应性单抗,命名为2D73。为了观察单抗2D73对四型病毒是否也具有交叉中和活性,我们采用本实验室建立的基于酶联免疫斑点技术的微中和实验方法(Enzyme-linked immunospot-based micro-neutralization test, ELISPOT-MNT),测定单抗对四型登革病毒的体外中和活性,结果显示单抗2D73对四型病毒均具有较强的中和活性,其50%抑制浓度(50%inhibited concentration, IC50)分别为0.28、0.16、0.18和18.82μg/ml。以用1日龄昆明乳鼠作为登革病毒感染模型进行抗体体内保护性效果评价,随着抗体浓度的增加,乳鼠发病时间延迟、存活率显著提高,呈明显的浓度依赖关系,对四型登革病毒表现出与体外中和活性相平行的体内保护作用。由于目前普遍认为病毒与靶细胞结合的位点位于EDⅢ,因此EDⅢ抗体可能在抑制病毒与细胞吸咐方面具有重要作用。为进一步揭示2D73中和作用的机制,我们采用前后吸咐试验检测抗体在阻断病毒与细胞吸咐的作用,结果发现抗体在前吸咐实验能有效抑制病毒感染细胞,而在后吸咐试验中抗体抑制感染效果明显降低,表明其中和作用主要通过抑制病毒与细胞表面受体的吸咐而有效阻断了病毒进入细胞。对重组EDⅢ蛋白与2D73抗体Fab段的晶体结构分析发现,单抗2D73所识别表位在四型登革病毒中高度保守(见另一博士论文)。上述结果提示我们,包括2D73在内的对DENV1～4中和活性强的抗体,它们所识别的高度保守性抗原表位有可能成为今后疫苗研制的重要靶标。第二部分：Ⅰ型登革病毒初次感染患者恢复期血清中和抗体效价与EDⅢ抗体滴度相关性分析明确登革病毒感染患者中和抗体的反应特点,对于登革疫苗有效性评估、登革热流行病学调查和感染诊断具有重要作用。目前对登革病毒中和抗体的研究大部分都基于鼠源性抗体,为了揭示天然免疫状况下登革病毒感染者的中和抗体反应特异性,以及明确抗体中和活性与EDⅢ抗体水平的关系,在本研究中,我们收集了30例明确诊断为Ⅰ型登革病毒初次感染的患者恢复期血清,利用ELISPOT-MNT测定每例血清对四型登革病毒的中和抗体效价。并建立一种特异、可靠的双抗原夹心ELISA法用于检测血清中EDⅢ特异性抗体的效价,该方法以酵母表达系统表达的重组EDⅢ蛋白作为抗原,捕获血清中的特异性EDⅢ抗体,分析血清对DENV-1的中和效价与同型特异性EDⅢ抗体效价的相关性。研究结果显示,这些患者的恢复期血清对DENV-1中和活性最强,而对其他三型病毒的中和活性远不如前者。这一结果提示,与登革病毒感染初期体内的抗体反应不同,随时间推移,体内针对其他血型的中和抗体中和活性下降,而同型特异性中和抗体的中和活性上升,成为最具优势的中和抗体。30例血清的EDⅢ抗体效价高低差异大,高者达到1：80,低者可低于临界值,对DENV-1的中和效价与血清型特异EDⅢ抗体效价的相关性进分析,发现两者不存在相关性(R=0.194,P=0.305),这一发现与目前认为的型特异性EDⅢ抗体并非介导同型登革病毒中和的主要抗体的理论相一致。小结综上所述,本研究取得以下成果：一、获得了一株对四型登革病毒交叉反应的EDⅢ鼠源性单抗,该抗体对四型登革病毒均有较强的体外中和活性,并具有与体外中和活性相平行的体内保护作用。它通过阻断病毒与细胞表面受体的吸咐而发挥中和作用。这一抗体可以进一步用于E蛋白广谱交叉抗原表位分析和抗登革病毒的治疗。并为新型登革疫苗的研制提供新的思路。二、建立了一种用于检测登革病毒感染患者体内EDⅢ抗体双抗原夹心ELISA法,由于该方法采用酵母表达系统表达EDⅢ重组蛋白,蛋白具有更好折叠性,更接近于天然构象。因此,以DENV-1EDⅢ重组蛋白作为包被抗原,以标记了HRP的DENV-1EDⅢ重组蛋白作为检测抗原,测定患者血清中的特异性EDⅢ抗体,具有更高的特异性、更好的可靠性。三、用快速高通量的酶联免疫斑点微中和实验方法测定30例Ⅰ型登革病毒初次感染患者三年后恢复期血清对四型登革病毒的中和效价,统计分析发现血清对同型病毒的中和效价最高,远高于对异型病毒的中和效价,证实了登革病毒初次感染可产生终生有效的同型中和抗体。但血清的对Ⅰ型登革病毒的强中和活性与血清型特异性EDⅢ抗体水平的高低无关。