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目的肿瘤基质微环境对于肿瘤的发生发展起着至关重要的作用。成纤维细胞作为肿瘤基质微环境中最主要的基质细胞之一,它通过直接的细胞接触、自噬行为、分泌信息分子等与基质微环境中的各组成成分发生交互作用,肿瘤和基质也常常被比作“种子”与“土壤”的关系。窖蛋白-1（Caveolin-1）是细胞质膜微囊（caveolae）的功能蛋白,主要参与细胞内外物质的转运、细胞的内吞以及细胞信号通路的调节等功能。Caveolin-1被认为是预测乳腺癌病人发生、发展和逆转的标志物,在临床上,Caveolin-1下降或阴性的乳腺癌病人,预后差,生存率低,乳腺癌晚期病人Caveolin-1均为阴性;而Caveolin-1阳性的病人,预后好,生存率高。本研究在体外将人成纤维细胞与人乳腺癌细胞共培养模拟肿瘤基质微环境,通过干扰成纤维细胞Caveolin-1的表达,力图探索Caveolin-1下调对成纤维细胞和乳腺癌细胞增殖的影响以及对成纤维细胞stromal cell-derived factor-1（SDF-1）,epidermal growth factor（EGF）和fibroblast-specific protein-1（FSP-1）表达的影响。方法1.细胞单独培养及共培养:细胞生长在含10%胎牛血清、100U/m L青霉素和10μg/m L链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养,当细胞生长至80%左右丰度时进行细胞传代。采用Transwell insert方法共培养人成纤维细胞株ESF和人乳腺癌细胞株BT-474,二种细胞不直接接触但生长在同一培养液中。2.si RNA Caveolin-1转染:采用Lipofectamine将si RNA Caveolin-1转入ESF细胞,RT-PCR和Western blot检测si RNA干扰后ESF细胞Caveolin-1 m RNA和蛋白的表达水平。3.RT-PCR:TRIzol-离心柱法提取细胞总RNA,总RNA的质量鉴定,逆转录合成c DNA,荧光定量PCR扩增。4.Western blot:提取ESF细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,8%或10%聚丙烯酰凝胶电泳,转移至PVDF膜,一抗4℃过夜,洗涤后,加入二抗,ECL显色,Image J软件分析各电泳条带光密度。5.流式细胞术:收集培养的ESF细胞,4%多聚甲醛溶液固定细胞,0.1%的Triton作用细胞,加入一抗37℃2 h,PBS洗涤后,加入Ig G-FITC,室温避光孵育60 min,PBS洗涤,FCM缓冲液重悬细胞,流式细胞仪检测。6.免疫荧光检测:细胞爬片洗涤后加入4%多聚甲醛溶液固定,Triton X-100作用细胞,PBS漂洗细胞,5%的BSA溶液作用细胞,加入一抗4℃孵育过夜,洗涤加入Ig G-FITC室温避光孵育,封片,荧光显微镜观察。7.统计学分析:实验结果用mean±SD表示,采用SPSS Statistics 17.0软件进行实验数据统计学分析,采用t检验方法比较两组间均数,P<0.05为统计学有显著差异,P>0.05为统计学无显著差异。结果1.si RNA Caveolin-1抑制了ESF细胞Caveolin-1的表达。与空白组比较,三组si RNA（si RNA-1、si RNA-2和si RNA-3）均干扰ESF细胞Caveolin-1的表达（P<0.05）;分别与si RNA-1组或si RNA-3组比较,si RNA-2抑制ESF细胞Caveolin-1 m RNA表达水平的效果更为显著（P<0.05）。表明si RNA Caveolin-1转入ESF细胞后靶向了Caveolin-1并干扰了其表达水平。2.si RNA Caveolin-1促进了ESF细胞和BT-474细胞增殖。与单独培养组比较,ESF细胞与BT-474细胞共培养条件下,si RNA Caveolin-1可促进ESF细胞的增殖（P<0.05）,表明成纤维细胞和乳腺癌细胞共培养形成的微环境与Caveolin-1下调对成纤维细胞的增殖有协同作用。检测si RNA Caveolin-1对BT-474细胞增殖的影响,BT-474+ESF si RNA组的BT-474细胞增殖显著高于BT-474+ESF组或BT-474组（P<0.05）,同样说明成纤维细胞和乳腺癌细胞共培养与si RNA Caveolin-1对乳腺癌细胞的增殖有协同作用。3.Caveolin-1下调促进了与BT-474共培养的ESF细胞EGF、FSP-1、SDF-1的表达水平。ESF细胞Caveolin-1表达水平下调对EGF、FSP-1、SDF-1 m RNA和蛋白的表达水平具有上调作用,ESF si RNA+BT-474共培养组EGF、FSP-1、SDF-1 m RNA和蛋白的表达水平上调幅度大,与单独培养的ESF组或ESF si RNA组比较,差异有显著性（P<0.05）。表明通过si RNA抑制ESF细胞表达Caveolin-1,同时在与肿瘤细胞共培养的微环境中可诱导肿瘤相关分子EGF、FSP-1、SDF-1m RNA和蛋白表达水平上调。结论1.建立了si RNA Caveolin-1人成纤维细胞模型,si RNA Caveolin-1有效抑制了人成纤维细胞Caveolin-1的表达水平。2.si RNA Caveolin-1促进了人成纤维细胞和人乳腺癌细胞的增殖,成纤维细胞与乳腺癌细胞的共培养加强了si RNA Caveolin-1促细胞增殖作用。3.Caveolin-1下调可在m RNA水平和蛋白水平上调人成纤维细胞EGF、SDF-1和FSP-1的表达水平。与乳腺癌细胞共培养能促进si RNA Caveolin-1上调EGF、SDF-1和FSP-1的作用。