长豇豆（Vigna unguiculata subsp.Sesquipedalis）是我国的一种重要蔬菜作物,在各省市区均有种植。作为一种喜温豆类作物,长豇豆耐热、耐旱,但不耐低温,在春提前和秋延后栽培过程中的低温会对植株生长及产量造成极大的影响。然而现在对长豇豆的耐低温研究主要停留在生理层面,耐冷分子机制的研究仍比较少。对长豇豆低温胁迫下的转录组进行分析一方面有助于揭示基因表达的动态变化,从而深入理解长豇豆对低温的响应机制;另一方面有助于鉴定控制耐冷性的候选基因,为开发与耐冷性相关的分子标记,实现耐冷标记辅助育种和利用生物技术创制耐冷豇豆新种质奠定坚实的基础。本研究以两个耐冷性不同的长豇豆品种“迪拜豇豆”和“宁豇三号”幼苗为研究材料,首先分析了在低温胁迫0、3、12、24 h和常温恢复3、12、24 h总共7个时间点的表型、叶片鲜重、脯氨酸和SOD含量。其次通过PacBio SMRT第三代测序技术构建了两个品种的全长转录组,并从中鉴定了可变剪接、可变聚腺苷酸化、新基因、非编码RNA、融合基因和转录因子。然后结合Illumina第二代测序技术和SMRT第三代测序技术分析了迪拜豇豆和宁豇三号在低温胁迫和常温恢复过程的转录组变化。最后克隆了在两个品种中差异表达的VuDREB1基因,利用生物信息学软件、原核表达和酵母单杂交分析了该基因及其编码产物的特征,并进一步克隆了VuDREB1基因的启动子,分析了不同长度的启动子片段在低温、高盐、干旱和ABA胁迫下的启动活性。主要结果如下:1.两个品种的表型及生理分析迪拜豇豆和宁豇三号幼苗在低温胁迫0、3、12、24 h和常温恢复3 h,叶片均出现了失水萎焉的症状,叶片鲜重均呈下降趋势,脯氨酸和SOD含量均呈上升趋势。而在恢复生长12 h和24 h,两个品种表现出一定的区别。宁豇三号叶片有所恢复,叶片鲜重增加,脯氨酸含量保持稳定,SOD含量逐渐下降。而迪拜豇豆叶片继续萎焉,叶片鲜重继续下降,脯氨酸含量有所下降,而SOD含量基本不变。在整个过程中宁豇三号的脯氨酸含量和SOD含量均高于迪拜豇豆。2.两个品种的全长转录组分析利用Pacbio SMRT第三代测序技术构建了迪拜豇豆和宁豇三号的全长转录组。在迪拜豇豆和宁豇三号中分别获得了55393条和45518条转录本,平均长度分别为2560bp和2342 bp。在这些转录本中约有7%为新基因的转录本,分别属于2990和2457个新基因。此外,在两个品种中分别鉴定出有7797和7419个基因发生了可变剪接,有9770和9473个基因具有可变多聚腺苷酸化位点,有370和330条融合基因,有1114和746条LncRNA,有3881和3714条转录因子。3.两个品种的转录组分析在低温胁迫0、3、12、24 h和常温恢复3 h,两个品种之间的基因表达相关性较高（＞0.88）,而在常温恢复12 h和24 h,两个品种之间的相关性较低,分别只有0.79和0.81,与主成分分析结果基本一致。常温恢复阶段的阶段特异性基因和WGCNA模块基因的GO富集结果接近,迪拜豇豆主要集中在细胞氨基酸代谢过程和一部分多肽生物合成与蛋白质翻译通路,而宁豇三号主要集中在完整的多肽生物合成和蛋白质翻译通路。而差异表达基因的GO富集结果主要集中在蛋白磷酸化、光合作用、氧化还原过程和细胞葡聚糖代谢。WGCNA分析在迪拜豇豆中鉴定出了18个模块,在宁豇三号中鉴定出了14个模块。利用低温胁迫24 h和常温恢复12 h两个阶段表达趋势相反的五个模块,构建了一个转录调控网络,发现CCA1基因可能是该网络的核心调控基因。4.VuDREB1基因及启动子的克隆与分析VuDREB1基因序列全长共994 bp,包含606 bp的开放阅读框,编码201个氨基酸,含有AP2结构域,属于DREB-A1亚组。将VuDREB1基因在大肠杆菌中进行表达,通过Western Blot检测到了目的蛋白条带,表明原核表达实验成功获得了目的蛋白。此外,利用酵母单杂交系统,将猎物质粒pGADT7-VuDREB1转化诱饵菌株Y1H[pAbAi-4-71],菌液能够在SD/-Leu/Ab A的平板上正常生长,表明VuDREB1蛋白能够与含DRE元件的71 bp片段结合。VuDREB1基因的启动子片段长度为1893 bp,含有多种调控元件,主要分为四大类:光响应元件（15个）,激素响应元件（10个）,MYB结合元件（4个）和其他元件（6个）。设计了五条5’缺失的启动子片段,替换pCAMBIA1301载体中的35S启动子,在豇豆愈伤组织中进行启动子活性分析。被含五个启动子片段农杆菌侵染的愈伤组织,在正常条件下均没有被GUS染色,而在4℃、NaCl、8%甘露醇和ABA胁迫下,这些愈伤组织均被染成了不同程度的蓝色。表明这五个片段中均存在相应胁迫的转录激活因子和抑制因子。