【摘 要】
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华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)是我国南方沿海地区的重要经济贝类,因其引起的食物过敏问题日益增多。本文以华贵栉孔扇贝为实验对象,纯化其主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM),对TM的致敏性、理化特性、IgE结合表位进行了系统分析,并探究美拉德反应对TM的IgE结合表位及致敏性的影响,为精准开发低致敏性食物提供了理论基础。本研究从华贵栉孔扇贝闭壳肌中分离纯化得到了36 k
【基金项目】
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国家重点研发计划基金(2019YFD0901703);
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华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)是我国南方沿海地区的重要经济贝类,因其引起的食物过敏问题日益增多。本文以华贵栉孔扇贝为实验对象,纯化其主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM),对TM的致敏性、理化特性、IgE结合表位进行了系统分析,并探究美拉德反应对TM的IgE结合表位及致敏性的影响,为精准开发低致敏性食物提供了理论基础。本研究从华贵栉孔扇贝闭壳肌中分离纯化得到了36 kDa的单一蛋白,经过液相色谱串联质谱及血清学实验验证其为主要过敏原TM。通过双向电泳、PAS染色证明TM是等电点为4.5的糖蛋白。热稳定性和p H稳定性实验结果显示,TM耐热耐酸碱。模拟胃肠液消化实验结果显示,胃蛋白酶和胰蛋白酶对TM的降解模式不同,TM耐胃蛋白酶消化,易被胰蛋白酶消化,但消化产物仍具有免疫结合活性。以贝类过敏患者血清中IgE作为靶蛋白,利用噬菌体展示肽库和“一珠一化合物”肽库对TM的表位进行亲和淘选,并结合生物信息学软件分析得到7个TM的模拟表位肽段,经Fmoc法固相合成,采用抑制性ELISA的方法进行验证,最终鉴定出7个TM的IgE线性表位(K7-L21、Q19-E33、N55-E66、K76-G87、A120-S134、S134-L148、K189-A202)。为降低TM的致敏性,构建了TM与D-木糖的美拉德反应体系(p H 8.5,WTM:WD-木糖=1:5,100℃加热30 min)。通过人克隆结肠腺癌细胞模型转运4 h后发现,美拉德反应产物(MR-TM)的转运能力降低25.3±0.2%。Dot blot分析结果显示,MR-TM的IgG和IgE免疫结合活性分别降低了58.9±0.3%、79.2±0.1%。嗜碱性粒细胞激活实验结果表明,MR-TM显著下调嗜碱性粒细胞表面CD63和CD203c的表达水平(p<0.05)。圆二色谱及表面疏水性分析发现,美拉德反应产物(MR-TM)的α-螺旋含量降低,表面疏水性增加。进一步,通过鸟枪法蛋白质组学检测美拉德反应修饰位点,发现TM的6个IgE结合表位上11个特定氨基酸(K12,R15,K28,K76,R125,R127,K128,R133,R140,K146,K189)被修饰,从而显著降低了TM的致敏性(p<0.05)。综上所述,本研究纯化鉴定了华贵栉孔扇贝的主要过敏原TM,明确TM的7个IgE线性表位,建立了消减TM致敏性的美拉德反应体系,阐明了TM的IgE结合表位特定氨基酸发生美拉德反应修饰是其致敏性显著降低的主要原因。
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